1、 食品安全国家标准 食品微生物学检验 食品中乳酸菌检验 GB 4789.352010 1 定义 乳酸菌是指一群通过发酵糖类产生大 量乳酸的细菌通称。 乳杆菌属 双歧杆菌属 链球菌属的嗜热链球菌 2 o本标准与GB/T 4789.35-2008相比，主要变 化如下： o 修改了乳酸菌总数、乳杆菌、双歧杆菌和 嗜热链球菌的计数方法。 o 本标准的附录A为规范性附录。 o 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： o GB 4789.35-1996、GB/T 4789.35-2003、 GB/T 4789.35-2008。 3 GB/T 4789.352003乳酸菌饮料中乳酸菌检验流程 4 o SN/
2、T 1941.1-2007: 检验方法有三部分： 第1部分：分离与计数方法； 第2部分：PetrifilmTM测试片法； 第3部分：乳杆菌的PCR法 5 SN标准 6 GB/T 4789.352008 乳酸菌饮料中乳酸菌检验修订 本标准与GB/T 4789.352003相比主要修 改如下： 将选择性分离培养基由改良TJA 培养基 （改良番茄汁琼脂培养基）改为MRS培养基 ； 增加API 50CH 诊断试剂条； 乳酸菌计数由倾注法改为涂布法。 7 2010版 8 样品制备 o 7.1.3 固体和半固体食品：以无菌操作称取25 g 样品，置于装有225 mL 生理盐水的无菌均质杯内 ，于8000
3、r/min10000 r/min 均质1 min2 min ，制成1:10 样品匀液；或置于225 mL 生理盐水的 无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min2 min 制成1:10 的样品匀液。 o 7.1.4 液体样品：液体样品应先将其充分摇匀后以 无菌吸管吸取样品25 mL 放入装有225 mL 生理盐 水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠 ）中，充分振摇，制成1:10 的样品匀液。 9 乳酸菌计数 o 乳酸菌总数 o 根据待检样品活菌总数的估计，选择2 个 3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取 0.1 mL 样品匀液分别置于2 个MRS琼脂平板 ，使用L 形棒进行表面涂布。
4、361， 厌氧培养48 h2 h后计数平板上的所有菌 落数。从样品稀释到平板涂布要求在15min 内完成。 10 乳酸菌计数 o 双歧杆菌计数 o 根据对待检样品双歧杆菌含量的估计，选择 2 个3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度 吸取0.1 mL样品匀液于莫匹罗星锂盐（Li- Mupirocin）改良MRS 琼脂平板，使用灭菌L 形棒进行表面涂布，每个稀释度作两个平板 。361，厌氧培养48 h2 h 后计数 平板上的所有菌落数。 11 乳酸菌计数 o 嗜热链球菌计数 o 根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计，选 择2 个3 个连续的适宜稀释度，每个稀释 度吸取0.1 mL样品匀液分别置于2 个
5、MC 琼 脂平板，使用L 形棒进行表面涂布。 361，需氧培养48 h2 h后计数。嗜 热链球菌在MC 琼脂平板上的菌落特征为： 菌落中等偏小，边缘整齐光滑的红色菌落， 直径2 mm1mm，菌落背面为粉红色。 12 乳酸菌计数 o 乳杆菌计数 o 乳酸菌总数结果减去 双歧杆菌与 嗜热链球 菌计数结果之和即得乳杆菌计数。 13 报告（GB/T4789.35-2008） o 根据菌落计数结果出具检测报告。最终确定 的乳酸菌菌落在30300之间的平板计数， 再乘以相应的稀释倍数，修约保留两位有效 数字，之后的数字，采用10的指数表示。参 照GB/T 4789.2规定。每克（或毫升）食品 中所含有的乳
6、酸菌数以CFU/g（mL）表示。 14 报告（GB4789.35-2010） o 7.3.1 选取菌落数在30 CFU300 CFU 之间、无蔓 延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 的 平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多 不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平 均数。 o 7.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不 宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释 度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余 一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘 以2，代表一个平板菌落数。 o 7.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长 时，则将每条单链
7、作为一个菌落计数。 15 结果的表述 o 7.4.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在 适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平 均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为 每g（mL）中菌落总数结果。 o 7.4.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在 适宜计数范围内时，按公式（1）计算： 16 17 o 7.4.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平 板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以 最高稀释倍数计算。 o 7.4.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释 倍数计算。 o 7.4.5 若所有稀释度
8、（包括液体样品原液）平 板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍 数计算。 o 7.4.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU300 CFU 之间，其中一部分小于30 CFU 或大于300CFU 时，则以最接近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 18 菌落数的报告 o 7.5.1 菌落数小于100 CFU 时，按“四舍五 入”原则修约，以整数报告。 o 7.5.2 菌落数大于或等于100 CFU 时，第3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2 位数字，后面用0 代替位数；也可用10 的 指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后 ，采用两位有效数字。 o
9、 7.5.3 称重取样以CFU/g 为单位报告，体积 取样以CFU/mL 为单位报告。 19 20 21 22 3M petrifilm 23 乳酸菌的鉴定 o 纯培养 o 挑取3个或以上的可疑菌落，嗜热链球菌接 种于MC琼脂平板，乳杆菌属接种于MRS琼脂 平板，兼性厌氧，置36 1恒温箱内培 养48 h2 h。双歧杆菌属鉴定按照GB/T 4789.34。 24 涂片镜检 o 乳杆菌属细胞形态多样，从长的杆状和细长 杆状到弯曲杆状及短杆状，一般形成链。通 常不运动。无芽胞，革兰氏染色阳性。嗜热 链球菌形态为球形或球杆状，直径为0.5 m 2.0 m，细胞成对或成链排列，无芽胞， 革兰氏染色阳性。 25 API 50CH生化鉴定试剂盒鉴定 o 刮取纯培养平板上的单个菌落，使用API 50CH 生化鉴定试剂盒进行生化反应检测， 表格列出了乳酸菌菌种主要生化反应。 26 27 28 29 30
