1、实验三 培养基的配制、分装和灭菌 1 一、实验目的 明确培养基的配制原理 通过对基础培养基的配制，掌握配 制培养基的一般方法和步骤 2 培养基是人工按一定比例配制的供微生物 生长繁殖和合成代谢产物所需要的 营养物质的混合物 培养基的原材料：碳源、氮源、无机盐、 生长因素、水 二、基本原理 3 根据微生物的种类和实验目的不同，培养基 有不同的种类 按成分：天然培养基，合成培养基，半合成培养基 按物理状态分：固体培养基，半固体培养基， 液体培养基 牛肉膏蛋白胨培养基 4 三、实验器材与试剂 溶液和试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂 1mol/L NaOH、1mol/L HCl 仪器或其它用具：三
2、脚架、培养基分装器、 天平、牛角匙、 高压蒸汽灭菌锅等 5 称量溶化调pH 过滤分装加塞 包扎灭菌搁置斜面 四、操作步骤 6 1）称量：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧 杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热 水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随 后放人热水中，牛肉膏便会与称量纸分离，立即取 出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 2）加热溶化：在烧杯中加入少于所需要的水量，并用玻棒 搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需 量。若配制固体培养基，则加入琼脂再加热 融化，此过程中需不断搅拌，以防琼脂糊底 或溢出，最后补足所失的水分。 7 3）调pH：检测培养基的pH，
3、若偏酸，可逐滴滴加1molL-1NaOH 边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH 范围。若偏碱，则用1molL-1HCl进行调节。 pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过 头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 4）过滤 趁热过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结 果的观察。但是供一般使用的培养基，该步可省略。 8 固体分装 5）分装：披实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角 瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶 口上面造成污染 分装量：固体培养基约为试管高度的15，灭菌后制成斜 面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。 半固体培养基以试管高度的
4、1/3为宜。灭菌后垂直 待凝 半固体 液体分装 试管 三角烧瓶 试管 三角烧瓶 1/3 1/4 1/2 1/5 1/2 9 6）加塞：试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制 作的棉塞。以阻止外界微生物进入培养，并保 持良好通气性 7）包扎：加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸，以防 灭菌时冷凝水沾湿棉塞 8）灭菌：将上述培养基以0.103MPa，121， 20min高压蒸气灭菌 9）搁置斜面：将灭菌的试管培养基冷至50左右（以防 斜面上冷凝水太多），将试管口端搁在玻 棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面 长度以不超过试管总长的一半为宜。 10 培养基分装 斜面制作 包扎成捆挂标签 11
5、附：高压蒸汽灭菌法 1加水 将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的 水，以水面与三角架相平为至。 2装料 将装料桶放回锅内，装入待灭菌的物品。装有培 养基的容器放置时要防止液体溢出，瓶塞不要紧 贴桶壁，以防冷凝水沾湿棉塞。 3加盖 将盖上的排气软管插人内层的排气槽内，再以两 两对称的方式同时旋转相对的两个螺栓，使螺栓 松紧一致，勿使漏气。 4排气 加热，待水煮沸后，水蒸汽和空气一起从排气孔 排出。一般认为，当水沸后约5min，表明锅内空 气已排净。 5升压 当锅内空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始 上升。 12 6保压 当压力表指针达到所需压力刻度时，控制热源。 开始计时并维持压力至所需时间。本实验用121 ， 20min灭菌。 7降压 达到所需灭菌时间后，关闭热源，让压力自然下 降到零后，打开排气阀。放净余下的蒸汽后，再 打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。 8无菌检查 将已灭菌培养基于37培养24h，无杂菌生 长，即可待用。 注意事项：使用灭菌锅应严格按照操作程序进行，避免发生事故；灭菌时，操 作者切勿擅自离开，务必待压力下降到零后，才可打开锅盖。 13
