1、对遗传算法的基本参数进行设置，如规模和代数等。b. 处理数据：一般来说，我们用二进制数来表示候选解，所以这一步我们需要对对随机生成的十进制种群转变，使得种群个体的数据类型是二进制。c. 适应度计算：对种群中每个个体的适应度进行计算并作为遗传的初始条件。d. 进化过程：在这个步骤中，将对生成的种群进行遗传操作并产生下一代全新种群。重复这一过程直到循环到我们所设定的设定值，将最后一代的最优个体进行转化，使得它成为十进制数。2.4人工神经网络和遗传算法分析 通过上面的算法介绍，我们可以了解到神经网络和遗传算法的原理和过程。事实上，两种算法从提出到现在，人们早已开始了对它们和切削工程优化的结合进行研究
2、。神经网络的映射优化对象中输入与输出的关系可以被用来替换一直以来的有限元计算。通常来说训练样本保证了神经网络结果的精度。遗传算法目前在切削优化领域被更多人使用，因为它很擅长解决那些复杂的非线性问题，且不依赖关于问题所涉及的领域。但是遗传算法通常在计算时需要巨量的初始个体组成的集合，并且需要进行大规模的迭代和循环次数，计算量过大会让研究者对于数据的处理变得复杂，容易出现错误。故本文选择神经网络进行加工过程优化的研究。2.5 总结这一章对可能要涉及的算法进行介绍和实现，完成对原理的探讨，并结合两种算法的比较，选择神经网络进行研究。（1） 介绍了人工神经网络及其类型，包括算法流程，原理，结构，适用于
3、本文所探讨的方法。（2） 对遗传算法GA原理和执行过程进行介绍。（3） 比价了两种算法的优缺点，结合实际情况选择神经网络进行本文的研究。3 加工过程基本问题以及模拟数据生成 本章主要内容探讨所涉及的切削加工过程的问题和原理。以及基于实际加工过程的可能所面对的问题和工件参数所涉及的物理几何信息，以此来生成模拟数据，为下一章节的神经网络模拟做数据准备。3.1加工工程问题探讨3.1.1切削加工基本原理 切削加工是指在确保消耗较少成本和维持高生产率的情况下，用刀具相对与工件运动，工件部分会产生应力引起内部断裂，没有使用的工件部分会成为切屑脱离出来，最后让工件达到设计要求的精度，和形状。而车削相对简单的
4、确保工件所有的加工面的位置精度，切削过程比较稳定，许可使用稍微大一点的切削用量，这些对生产率的上升很有用。3.1.2切削的变形 切削的过程中，塑性变形是加工过程中的一种重要现象。由于遭受刀具的挤压，通常会造成变形，变形是切削过程常见的物理现象。许多因素都与切削过程的工件材料变形有着重要的关联，例如切削力和热，刀具的磨损等等。 在切削加工过程中，一个塑性变形过程，就是除去多余的工件材料。滑移出现在刀具前刀面压靠切削层，在高速和高温的处境下，就很容易出现滑移。如图3-1加工材料的滑移线，由图可知道，在加工过程中，金属材料变形可分为3个区域图3-1 切削加工材料的滑移线（1） 第一变形区 切削刃附近
5、切削层，会有一个变形区这个变形区就是第一变形区。它是金属的剪切滑移变形。切削层在到受刀具的影响后，在第一变形区塑性变形后形成切屑。受到刀具正面和切削刃的挤压的切削层，会使得切削刃附近的金属先产生弹性变形，紧接着塑性变形，金属晶格会出现滑动现象。第一变形区是切屑的变形区，其特征是切削层的剪切滑移变形。（2） 第二变形区切屑层与前刀面相接所产生的变形区，许多人也称它为第二变形区，其内部的金属因为挤压摩擦而产生了变形。经过第一变形区后，克服了前刀面切屑挤压产生的摩擦力，成形的切屑将沿前刀面方向排出。值得留意的是，第一变形区和第二变形区是互相联系的。前刀面摩擦力大时，排屑不顺畅，挤压变形加剧，使第一变
6、形区的剪切滑移变形增大。（3） 第三变形区 切削刃附近加工表面产生的变形区，又被叫做第三变形区，里面的金属是受到挤压和摩擦变形。加工表面受到刃口钝部和背面的挤压和摩擦，导致纤维化和一定程度的加工硬化。上述三个变形区域在刀具刃口附近聚集，因此此处的应力相对集中且复杂，待切割的切割层与共建材料分散在一起。切削速度方向和剪切面之间的角度称为剪切角。一般来说，剪切角与切削力有相当大的关系。所以，通常剪切角是作为判断切削过程的一个信号。相同的工件材料，在其他相关条件相同的情况下，随着切削速度越高，剪切角就会越大，切削面积就会变小，切削力也随之变小。通过以上探讨，切削过程的工件材料塑性变形主要形式是剪切滑
7、移。3.1.3影响切削力因素切削力会受到不同的因素带来的影响，并且因素之间的影响规律都部相同，常见的影响因素如工件材料，切削参数等。1） 工件材料对切削力的影响工件材料有许多原因会导致切削力的大小受到影响，一般来说其化学成分，物理性能，加工前状态都是影响切削力的主要原因。值得注意的是，所产生的切削力的大小会随着工件材料的硬度和强度的增大而增大。另外容易被忽视的一点就是工件的化学成分多少，它也会对切削力造成不小的影响，比如碳素钢的碳元素和合金元素比例就对材料的强度和硬度有着影响，会对切削力造成影响。2） 背吃刀量对切削力的影响背吃刀量增加，相应的切削面积也会增加，而单位切削力并不会出现变化，因而
8、切削力会上升。通常来说，背吃刀量和切削力是正相关的关系，背吃刀量扩大一倍，切削力也会扩大一倍。3） 进给量对切削力的影响如果进给量增大，那么切削力也会增大。切小面积会上升，进一步造成变形系数和摩擦系数下降，变形状态下降，导致切削力下降。而此时它的切削功率会上升，切削力也就增大了。以上两种作用结合造成的结果就是进给量增大切削力也会增大，但是不构成正比关系。3.2模拟数据生成我们知道切削加工过程是有一定规章律令的物理过程，这些规律就体现在数据中。模拟数据所具有的规律性远远大于真实数据。所以，本文所实验的方法如果能在模拟数据身上能够进行工作，那么不言而喻也可以对真实数据实现相同功能。按照上述理论观点
9、，我们将对具体的加工实例进行模拟数据产生。本文用钛合金的车削加工作为实际的加工例子，根据以此来产生各种加工资源的模拟数据。本文中的数据包括参数。包含在工件、加工要求和机床中的数据称为参数数据。这种数据是在我们根据理论得到的数据范围内任意生成的。3.2.1工件材料模拟数据生成材料物理性能直接对金属材料的切削性能起着重大的影响。举个例子来说，我们所关心的材料的硬度、强度、导热系数、线膨胀系数、摩擦系数和断面收缩率等物理性能都会或多或少的影响着材料的切削性能。材料可以被那些常常用来测量金属材料热处理后的物理性能的测量设备所得的测量值来表示。显而易见的是，这些可以直接用数来表示的物理性质可以很非常简单
10、地从不同种金属材料手册中得到。可以在几何层次上表示工件的参数，就是加工特征。然而，只是对加工特征的探讨很难对切削过程进行全面的标定。一般来说，与切削层的6种刀具路径联合，一种工件可以被分成一组对应的加工特征，进一步的每一种加工特征又分解成一组刀具路径。本文所使用的材料TC4钛合金，具有优异的北京理工大学珠海学院2020届本科生毕业设计毕业设计曲妥珠单抗原液生产车间工艺设计学 院：专 业：姓 名：指导老师：材料与环境学院生物工程廖德锟学 号：职 称：160504104038王莹正高级工程师中国珠海二二年五月诚信承诺书本人郑重承诺：本人承诺呈交的毕业设计曲妥珠单抗原液生产车间工艺设计是在指导教师的
11、指导下，独立开展研究取得的成果，文中引用他人的观点和材料，均在文后按顺序列出其参考文献，设计使用的数据真实可靠。本人签名： 日期： 年 月 日曲妥珠单抗原液生产车间工艺设计摘 要曲妥珠单抗是针对HER2蛋白细胞外区域的重组人源化单克隆抗体，用于治疗过表达HER2的转移性乳腺癌（MBC）1。单药治疗可用于已接受过一个或多个化疗方案的转移性乳腺癌；可与紫杉醇联合治疗未接受过化疗的转移性乳腺癌。本设计为曲妥珠单抗原液生产车间工艺设计，设计内容主要包括种子细胞复苏及培养扩增、抗体纯化、设备选型、车间布置图设计等。本设计以生物反应器、深层过滤系统、Protein A亲和层析等方法对曲妥珠单抗原液进行生产
12、。在满足工艺条件下，遵循高效率，低能耗，低成本的原则，设计符合GMP要求的曲妥珠单抗原液生产车间布置方案。关键词：曲妥珠单抗；乳腺癌；生物反应器；抗体纯化；车间布置 Process design of trastuzumab monoclonal antibody Manufacturing Production WorkshopsAbstractTrastuzumab is a recombinant humanized monoclonal antibody directed against the extracellular region of the HER2 protein for
13、the treatment of metastatic breast cancer (MBC) overexpressing HER21. Monotherapy can be used for metastatic breast cancer that has received one or more chemotherapy regimens; it can be combined with paclitaxel to treat metastatic breast cancer that has not received chemotherapy.This design is the P
14、rocess design of trastuzumab monoclonal antibody Manufacturing Production Workshops. The design contents mainly include seed cell recovery and culture expansion, antibody purification, equipment selection, and workshop layout design. The design uses a bioreactor, a deep filtration system, and Protei
15、n A affinity chromatography to produce trastuzumab antigen solution. In accordance with the process conditions, following the principles of high efficiency, low energy consumption and low cost, the layout of the trastuzumab trastuzumab monoclonal antibody Manufacturing Production Workshops in compli
16、ance with GMP requirements was designed.Key words: trastuzumab; breast cancer; bioreactor; antibody purification; workshop layout目 录1引言11.1单克隆抗体11.2乳腺癌21.3曲妥珠单抗31.3.1简介31.3.2作用机理31.2.3发展趋势41.2.4本设计的目的意义42工艺流程52.1生产工艺的选择52.2生产工艺流程52.2.1细胞复苏及扩大培养52.2.1.1 细胞复苏及细胞传代52.2.1.2 种子罐扩增培养62.2.1.3 2000L生物反应器培养6
17、2.2.2抗体纯化72.2.2.1 深层过滤系统72.2.2.2 Protein A亲和层析82.2.2.3 低pH孵育82.2.2.4阳离子交换层析92.2.2.5阴离子交换层析92.2.2.6病毒过滤102.2.2.7原液分装102.3工艺关键参数112.3.1细胞培养112.3.1.1 培养基112.3.1.2 pH值112.3.1.3温度112.3.1.4机械搅拌强度112.3.1.5 渗透压113工艺衡算及设备选型123.1物料衡算123.1.1细胞复苏至2000L生物反应器物料衡算123.1.1.1 DynamisTM medium123.1.1.2 Efficient Feed
18、C+123.1.1.3 Gibco L-Gln(200mM)123.1.2发酵液纯化工艺物料衡算133.1.2.1 层析填料衡算133.1.2.2 纯化的各种缓冲液153.2耗热量计算203.2.1加热培养基耗热量Q1203.3耗冷量计算213.3.1 Protein A层析缓冲液配制后降温耗冷量Q2213.3.2低pH孵育缓冲液降温耗冷量Q3213.3.3阳离子层析缓冲液配制后降温耗冷量Q4223.3.4阴离子层析缓冲液配制后降温耗冷量Q5223.4注射用水衡算233.5设备选型243.5.1设备选型目的及意义243.5.2设备选型原则243.5.3设备选型方法253.5.4主要大型设备选型
19、264生产车间布置设计334.1设计目的334.2设计依据334.3车间布置原则344.3.1生产工艺要求344.3.2生产操作要求344.3.3设备安装、检修要求344.3.4洁净度要求34参考文献35致谢37附录1：曲妥珠单抗原液生产车间平面布置图38附录2：曲妥珠单抗原液生产车间人物流安排图3961北京理工大学珠海学院2020届本科生毕业设计1引言1.1单克隆抗体抗体(Abs)是一种免疫系统蛋白，能够识别和结合外来物质，具有很高的亲和力。抗体技术是20世纪最重大的科学成就和当前最重要的科学前沿技术之一，被称为生命科学和生物技术产业将发生重大突破性的领域1。2013年生产了近10吨抗体产品
20、，市场价值超过750亿美元。目前，单克隆抗体及相关分子的年增长率估计在10%左右，这意味着到2020年该市场可能会翻一倍。今天，一些轰动一时的产品，如利妥昔单抗和恩布尔，每年的全球需求量超过了1吨2。单克隆抗体是治疗多种疾病的生物药物，它们能够特异性地与几乎任何靶分子结合，被广泛用于诊断和治疗，特别是在肿瘤学领域。随着越来越多生物技术工具的出现，现在可以通过基因工程生产完全人源化的单克隆抗体，这些抗体直接针对预期的靶点1。单克隆抗体通过不同的手段来发挥作用，有以下几种方式：1标记癌细胞一些免疫系统细胞依靠抗体来定位攻击的目标。涂有单克隆抗体的癌细胞可能更容易检测到并靶向破坏。2使细胞膜破坏某些
21、单克隆抗体可以激发自身的免疫系统，对癌细胞发生应答，从而破坏癌细胞膜。阻止细胞生长。此外，某些单克隆抗体会阻断癌细胞与促进细胞生长的蛋白质之间的连接，而这种活动是肿瘤生长和存活所必需的。3.防止血管生长为了使癌性肿瘤生长和存活，需要血液供应。一些单克隆抗体药物阻断了新血管发育所必需的蛋白质-细胞相互作用。4阻断免疫系统抑制剂与免疫系统细胞结合的某些蛋白质是阻止系统过度活跃的调节因子。与这些免疫系统细胞结合的单克隆抗体为抗癌细胞提供了以更少的抑制作用工作的机会。5.直接攻击癌细胞即使某些单克隆抗体是为其他目的设计的，但它们可能会更直接地攻击细胞。当这些抗体中的一些附着在细胞上时，细胞内部的一系列
22、事件可能导致其自毁。1.2乳腺癌乳腺癌是女性健康问题影响最大的疾病之一，每年影响210万女性，并且导致女性中与癌症相关的死亡人数最多。据统计有六十二万名女性因乳腺癌而死，其死亡人数大概占女性癌症疾病总死亡人数的15。虽然较发达地区的女性乳腺癌发病率较高，但全球几乎每个地区的乳腺癌发病率均在上升。受生活方式、生殖观念的改变等因素影响，我国乳腺癌的发病率逐年上升3。我国乳腺癌发病率的增长速度高于世界平均增长速度，根据相关数据表明，中国乳腺癌新增发病人数和死亡人数分别占全球人数的12.1%和9.6%4。乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。乳腺癌中99%发生在女性，男性仅占1%。靠近乳房的地方有一
23、个淋巴腺网络（也称淋巴结）。它们是遍及全身的淋巴系统的一部分。淋巴结和淋巴管中含有淋巴液，流经淋巴系统,游离的癌细胞可以随淋巴液转移全身，危及生命。手术后和手术后使用的药物称为辅助治疗。手术前的化学疗法或其他类型的疗法称为新辅助疗法5。当前，用于辅助性乳腺癌治疗的药物主要分为三类：激素阻断剂，化学疗法和单克隆抗体。1激素疗法一些乳腺癌需要雌激素才能继续生长。可以通过它们表面上的雌激素受体（ER+）和孕激素受体（PR+）的存在来识别它们。2化学疗法化学疗法主要用于2-4期的乳腺癌，对雌激素受体阴性（ER-）效果显著。化学疗法药物联合使用，通常为3-6个月。大多数化学疗法通过破坏复制后的DNA或通
24、过其他机制破坏癌细胞来发挥作用。但是，药物也会损害快速生长的正常细胞，这可能会导致严重的副作用。3单克隆抗体曲妥珠单抗是HER2的单克隆抗体，已将1-3期HER2阳性乳腺癌的5年无病生存率提高了约87（总生存率95）6。25至30的乳腺癌过表达 HER2基因或其蛋白产物，而HER2在乳腺癌中的过表达与疾病复发和预后不良有关。1.3曲妥珠单抗1.3.1简介曲妥珠单抗是抗HER2人源化单克隆抗体,主要用于治疗HER2过表达的乳腺癌，是治疗乳腺癌的最佳选择之一。1998年9月25日美国上市、2002年9月国内获批。曲妥珠单抗是靶向erbB2（酪氨酸激酶受体，也称为HER2或HER-2/neu）的单克
25、隆抗体7。HER2是细胞表面的蛋白质或蛋白质构件称为受体，该受体将信号从细胞表面传递到细胞核。正常细胞仅具有相对少量的HER2受体，如果肿瘤细胞上的此类HER2受体过多，则细胞会频繁分裂，并且肿瘤会快速不受控制地生长。HER2形成的增加发生在约15-20的乳腺癌患者中8。HER2驱动癌细胞发展更具侵略性的表型，转移至内脏和中枢神经系统，并且对化疗药物的敏感性降低9。曲妥珠单抗仅用于治疗过表达erbB2的特定肿瘤，这些肿瘤被称为“HER2阳性”肿瘤。1.3.2作用机理曲妥珠单抗一种是免疫靶向疗法的例子，它的的作用机理是将自身附着于乳腺癌细胞上的的HER2受体，抑制了过表达HER2的肿瘤细胞的增殖
26、10,并阻止其接收生长信号，以改善HER2阳性乳腺癌的生存率，如图1-1。此外，通过引导免疫系统破坏其所附着的癌细胞来帮助对抗乳腺癌也是曲妥珠单抗的另一种途径11。图11 曲妥珠单抗原理1.2.3发展趋势2002年，曲妥珠单抗开始进入中国医疗药品市场，年销售额从2007年的不到七千万元人民币增加到2017年的八亿元人民币，2007-2017年的复合年增长率达到30.412。2018年全球生物药物销售榜前十中，有六个为单克隆抗体药物，其中阿达木单抗以全球销售额约199.36亿美元，刷新了生物药品销售史。1.2.4本设计的目的意义单克隆抗体因具有针对抗原靶点，选择性高，副作用小的特点，使得其医治效
27、果远远好于传统药物；此外，单克隆抗体结构复杂、分子量大和工艺壁垒极高的特点，使单抗药物很难被仿制、生产规模难以放大。对于曲妥珠单抗而言，我国HER2阳性乳腺癌患者接受抗HER2治疗的人数占比不到20%，并且国内许多医院出现断货情况。对曲妥珠单抗的生产工艺以及生产车间的研究，有望使其在我国成为治疗HER2乳腺癌的标准一线方案，并且有助于使我国能有更多的HER2阳性乳腺癌患者接受抗HER2治疗。此外，设计优良的抗体生产工艺有助于打破外国生物制药巨头对我国抗体药物的垄断，提高我国在国际抗体药物领域的地位和竞争优势。2工艺流程2.1生产工艺的选择单克隆抗体的大规模生产利用哺乳动物的生产系统，然后通过连
28、续的色谱和膜过滤步骤进行细胞去除和纯化，不断地将产物和非产物的杂质降低到可接受的水平。单克隆抗体稳定、高产量生产工艺的快速发展是生物制药领域的一个重要研究热点。随着对更广泛产品的经验的积累，这些平台正在不断发展。本设计工艺选择在遵循适用性和可靠性的前提下，采用具有先进性和前瞻性的工艺流程。2.2生产工艺流程2.2.1细胞复苏及扩大培养第一个阶段工作为获得目标产物。细胞在扩增阶段生长并形成产物，目标产物会分泌到上清液中，将细胞和产物的混合物通过深层过滤系统，即可获得目标产物。工作从从种子细胞的复苏开始，接种到摇瓶中在37，5% CO2，130rpm培养条件的环境下进行细胞传代及小规模扩增，达到要
29、求后，经历3级种子罐的扩增后，转移至XDR-2000一次性生物反应器中进行大规模培养。图21 细胞复苏及扩大生产工艺流程图2.2.1.1 细胞复苏及细胞传代1.细胞复苏从液氮罐中取出所需的种子细胞，放置于37水浴锅融化，离心重悬后接种于含70ml Dynamis AGT 培养基的250ml摇瓶（带换气口）中，放置于培养箱中培养。（37，5CO2，130rpm）2.细胞传代培养2-3天后，待摇瓶中细胞密度达到2.0-3.0106 cells/ml，进行细胞传代，共传5个250ml毫升摇瓶，接种密度为0.5106 cells/ml，培养条件为37，5CO2，130rpm。待摇瓶中细胞密度达到2.0
30、-3.0106 cells/ml,按1：4稀释接种于2L种子罐中进行培养。2.2.1.2 种子罐扩增培养2L种子罐扩培：培养基为添加2mM L-Glutamine (Gibco 200mM )的 Dynamis AGT培养基。（37，ph7.00.2，130rpm）待摇瓶中细胞密度达到2.0-3.0106 cells/ml,按1：4稀释接种于10L种子罐中进行培养，培养基为添加2mM L-Glutamine (Gibco 200mM )的 Dynamis AGT培养基。（37，ph7.00.2，130rpm）10L种子罐扩培：2L种子罐培养2-3天后，细胞密度达到2.0-3.0106 cell
31、s/ml, 按1：5稀释接种于100L种子罐中进行培养。（37，ph7.00.2，120rpm）100L种子罐扩培：在培养的第4、6天各添加Eifficient FeedTM C+ (Gibco)补料5L。培养的第七天后，细胞密度达到16-19106 cells/ml，收集细胞液转移到生产罐中。2.2.1.3 2000L生物反应器培养将100L种子罐种子细胞无菌转移到2000L生物反应器中，起始体积为1700L，细胞密度为0.3106 cells/ml，培养条件（37，ph7.00.2，50rpm）。细胞培养第五天和第十天，添加Eifficient FeedTM C+ (Gibco) 补料各5
32、0L，总体积1800L。每天取样计数，在第15-20天，细胞活力下降到80%，收集所有细胞上清。2.2.2抗体纯化由于在第一阶段工作中，产物澄清液中存在潜在的病毒、泄漏的亲和配基、抗体的聚集体、宿主DNA、内毒素等，都必须将其去除将含量降到极低的水平，以此来保障产品的安全问题。抗体药物在纯化过程中，杂质的去除效果直接影响产品质量。制备的抗体的纯度关键取决于所选择的纯化方法，因此，要求采用高效、优良的分离纯化工艺，并对每步工艺进行深入研究。第二阶段工作从经过深层过滤系统的上清液开始，首先将上清液进行Protein A亲和层析工艺，去除大部分的杂蛋白；鉴于Protein A亲和层析是在低pH条件下
33、洗脱样品，所以在层析结束后进行低pH孵育来灭活病毒；过滤洗脱液后，经阴阳离子交换层析、病毒过滤工艺，以去除极小概率可能存在的病毒颗粒，即可得到单抗原液。该生产过程须有严格的温湿度控制和较为完整的病毒防范措施。该生产过程须有严格的温湿度控制和较为完整的病毒防范措施。下图为本设计抗体纯化的技术路线：图22 抗体纯化流程图2.2.2.1 深层过滤系统本设计采用两级深层过滤的方法对培养液上清进行初步澄清，将培养液上清液与细胞和细胞碎片分离。深层过滤是目前国内外澄清培养液的主要方法，其原理是流动相通过深层过滤时，多孔介质截留其中的固体颗粒。大部分介质表面带正电荷,通过静电吸附来拦截杂质颗粒。深层过滤介质
34、层一般选用较厚的滤床类，小于介质空隙的颗粒可进入到长而曲折的孔道中被截留，使其附着于介质上。本设计采用Millistak+Pod一次性深层过滤系统。将深层过滤膜片安装至深层过滤系统中，所述过滤膜片按过滤顺序先后为D0HC和A1HC两种型号；首先，用纯化水排空滤器内的气体，并充分浸润滤器，发酵液过滤前测浊度。利用蠕动泵在100LMH - 300LMH的流速使细胞液通过滤器。2.2.2.2 Protein A亲和层析第一步抗体捕获步骤选择的亲和色谱配体，Protein A与抗体Fc片段的特异亲和性和优异的纯化倍数以及工艺的简易性成为应用最广泛的大规模蛋白分离亲和技术。缓冲液制备：平衡缓冲液：25m
35、M Tris-HCL75mM NaCl，ph7.20.2洗脱缓最茀眀愀瀀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀耀闔刁/Mi前台访问/p-1211368.html116.179.32.2020吤攀茀眀愀瀀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀舀闔刁/a前台访问/BookRead.aspx?id=2949555203.208.60.810劦最瀀栀琀洀氀萀闔刁/Mg前台访问/p-1699452.html54.36.148.2470眅最瀀栀琀洀氀蘀闔刁/Ke前台访问/p-590029.html116.179.32.240眅椀瀀栀琀洀氀蠀闔鰀刁/Mk前台访问/p-2931783.html220.181.108.1660眅最瀀栀
36、琀洀氀言闔刁/Mg前台访问/p-2665387.html54.36.148.1720眅最瀀栀琀洀氀谀闔刁/Mk前台访问/d-1342462.html220.181.108.1680眅欀瀀栀琀洀氀踀闔刁5Sowap前台访问/p-1598365.html116.179.32.1380%劦最瀀栀琀洀氀退闔刁惲/Mg前台访问/d-1517397.html185.191.171.80%劦最瀀栀琀洀氀鈀闔刁/Mi前台访问/p-2945174.html61.143.208.2280攀瀀栀琀洀氀鐀闔刁/Ki前台访问/p-368981.html220.181.108.1680劦椀搀栀琀洀氀阀闔吓刁/a前台访问/
37、BookRead.aspx?id=294517461.143.208.2280崀眀琀愀最眀甀氀椀砀甀攀挀椀搀椀愀渀栀琀洀氀頀闔耓刁/Mk前台访问/d-1888739.html220.181.108.1650劦最瀀栀琀洀氀騀闔刁5Smwap前台访问/d-2423317.html116.179.32.760%劦椀搀栀琀洀氀鰀闔刁/Mk前台访问/d-1390812.html220.181.108.1590%劦最瀀栀琀洀氀鸀闔刁/Mg前台访问/p-2874734.html116.179.32.690%劦椀瀀栀琀洀氀闔尀刁5Sowap前台访问/d-2923428.html116.179.32.1970%
38、劦最瀀栀琀洀氀闔刁/Mk前台访问/p-2771318.html220.181.108.1040劦匀洀眀愀瀀搀栀琀洀氀闔刁/前台访问/free-00002-118-6120-0-0-0-0-1-1-2.html203.208.60.1220勈伇最瀀栀琀洀氀闔刁/Mg前台访问/d-2935987.html116.179.32.320埿攀脀眀愀瀀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀闔搀刁5Sowap前台访问/d-1374781.html220.181.108.750劦欀瀀栀琀洀氀闔退刁/Mk前台访问/p-2878204.html220.181.108.1040匀焀眀愀瀀瀀栀琀洀氀闔刁/a前台访问/BookRead.aspx?id=2878204111.206.198.490劦最瀀栀琀洀氀闔刁/Ke前台访问/p-983313.html54.36.148.2470伇椀瀀栀琀洀氀闔刁/Mg前台访问/d-2918946.html116.179.32.400埿最脀眀愀瀀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀闔刁惲/G_前台访问/n-5704.html70.36.101.710劦匀焀眀愀瀀搀栀琀洀氀闔頀刁/Mi前台访问/p-2892294.html116.179.32.1490
