1、DNADNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定 1 一、基础知识一、基础知识 （一）提取（一）提取DNADNA的方法的方法 1 1、提取生物大分子的基本思路、提取生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理 或化学性质的生物大分子或化学性质的生物大分子 2 2、提取、提取DNADNA的基本思路的基本思路 利用利用DNADNA与与RNARNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性、蛋白质和脂质等在物理和化学性 质方面的差异，提取质方面的差异，提取DNADNA，去除其他成分，去除其他成分 2 3 3、DNADNA的溶解性的溶解性 DNADNA和蛋白质等其
2、他成分和蛋白质等其他成分在不同浓度的在不同浓度的NaClNaCl溶液溶液 中溶解度不同中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐，利用这一特点，选择适当的盐 浓度就能使浓度就能使DNADNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者充分溶解，而使杂质沉淀，或者 相反相反 3 根据根据DNADNA在在NaClNaCl溶溶 液中的溶解度曲线液中的溶解度曲线 图，思考在什么浓图，思考在什么浓 度下，度下，DNADNA的溶解度的溶解度 最小？最小？ DNADNA在在NaClNaCl 溶液中的溶解度是溶液中的溶解度是 如何变化的如何变化的？ DNA在NaClNaCl溶液中的溶解度曲线图溶液中的溶解度曲线图 在NaCl溶
3、液浓度低于 0.14 mol/L时，DNA的溶 解度随NaCl溶液浓度的 增加而逐渐降低；在 0.14 mol/L时，DNA溶解 度最小；当NaCl溶液浓 度继续增加时，DNA的溶 解度又逐渐增大。 如何通过控制如何通过控制NaClNaCl溶液溶液 的浓度使的浓度使DNADNA在盐溶液中在盐溶液中 溶解或析出？溶解或析出？ 当氯化钠的物质的量浓 度为 2 molL时，DNA 的溶解度最大，浓度为 014 molL时，DNA的 溶解度最低。利用这一 原理，可以使DNA在盐溶 液中溶解或析出。 4 DNADNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质 则可以溶于酒精
4、。利用这一原理，可以将则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNADNA 与蛋白质进一步分离与蛋白质进一步分离 5 5、DNADNA在酒精溶液中的溶解性在酒精溶液中的溶解性 6 6、DNADNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性对酶、高温和洗涤剂的耐受性 蛋白酶能水解蛋白质，但是对蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNADNA没有影响没有影响 大多数蛋白质不能忍受大多数蛋白质不能忍受60608080的高温，而的高温，而 DNADNA在在8080以上才会变性以上才会变性 洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和 蛋白质蛋白质, ,但对但对DNADNA没有影响没有影响 5 6 7
5、 7、DNADNA的鉴定的鉴定 DNADNA与与二苯胺（沸水浴）二苯胺（沸水浴）会染成会染成蓝色蓝色，因此，因此， 二苯胺可以作为鉴定二苯胺可以作为鉴定DNADNA的试剂的试剂 7 二、实验设计二、实验设计 （一）实验材料的选取（一）实验材料的选取 1 1、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血 、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠 菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选 取取2 23 3种实验材料）种实验材料） 2 2、原则：凡是含有、原则：凡是含有DNADNA的生物
6、材料都可以考的生物材料都可以考 虑，但选用虑，但选用DNADNA含量相对较高的生物组织，成功含量相对较高的生物组织，成功 的可能性更大的可能性更大 8 动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中 加入一定量的蒸馏水加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻璃棒搅拌，同时用玻璃棒搅拌， 过滤后收集滤液即可过滤后收集滤液即可 （二）破碎细胞，获取含（二）破碎细胞，获取含DNADNA的滤液的滤液 1 1、动物细胞、动物细胞 答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体， 水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再水分可以大量进入血细胞内
7、，使血细胞胀裂，再 加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂 ( (细胞膜和核膜的破裂细胞膜和核膜的破裂) )，从而释放出，从而释放出DNADNA 讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 9 植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解 细胞膜细胞膜 2 2、植物细胞、植物细胞 讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？ 答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜 ，有利于，有利于DNADNA的释放；食
8、盐的主要成分是的释放；食盐的主要成分是NaClNaCl， 有利于有利于DNADNA的溶解的溶解 实例：提取洋葱实例：提取洋葱DNADNA时，在切碎的洋葱中加入时，在切碎的洋葱中加入 一定的洗涤剂和食盐，进行从分的搅拌和研磨一定的洗涤剂和食盐，进行从分的搅拌和研磨 ，过滤后收集研磨液，过滤后收集研磨液 10 答：研磨不充分会使细胞核内的答：研磨不充分会使细胞核内的DNADNA释放不完全释放不完全 ，提取的，提取的DNADNA量变少，影响实验结果，导致看不量变少，影响实验结果，导致看不 到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等 讨论：如果研磨不充分，会对实验结果
9、产生怎样讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样 的影响？的影响？ （三）去除滤液中的杂质（三）去除滤液中的杂质 为了纯化提取的为了纯化提取的DNADNA需要将滤液作进一步处理需要将滤液作进一步处理 讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞 成分？成分？ 答：可能含有核蛋白、多糖和答：可能含有核蛋白、多糖和RNARNA等杂质等杂质 11 12 讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？ 答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而 使提取的使提取的DNADNA与蛋白质分开；方案三利用
10、的是与蛋白质分开；方案三利用的是 DNADNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白 质变性，与质变性，与DNADNA分离分离 13 （四）（四） DNADNA的析出与鉴定的析出与鉴定 DNADNA的析出用的是与滤液体积相等的的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶冷却的酒精溶 液（体积分数为液（体积分数为95 95 ） ，静置，静置2 23min3min，溶液中，溶液中 会出现会出现白色丝状物，白色丝状物，这就是粗提取这就是粗提取DNADNA。用玻璃棒。用玻璃棒 沿沿一个方向一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上 面的水
11、面的水 1 1、DNADNA的析出的析出 14 15 2 2、 DNADNA的鉴定的鉴定 鉴定鉴定DNADNA时在试管中先加入物质的量的浓度为时在试管中先加入物质的量的浓度为 2mol/L 2mol/L 的的NaClNaCl溶液溶液5ml5ml于两只试管中，其中一只于两只试管中，其中一只 加入加入DNADNA丝状物，各加入丝状物，各加入二苯胺二苯胺4ml 4ml 试剂。混合试剂。混合 均匀后，将试管置于均匀后，将试管置于沸水中加热沸水中加热5min,5min,待试管冷待试管冷 却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶 解有解有DNADNA的溶液是否有
12、的溶液是否有蓝色蓝色 16 鸡血细胞液中鸡血细胞液中DNADNA的粗提取实验流程图的粗提取实验流程图 17 2mol/L2mol/L 鸡血细胞液中鸡血细胞液中DNADNA的粗提取实验流程图的粗提取实验流程图 18 5 5、过滤、过滤取纱布上的滤物取纱布上的滤物 纱布过滤纱布过滤 6 6、再次溶解、再次溶解DNADNA 2mol/LNaCl2mol/LNaCl溶液溶液 取滤物取滤物 鸡血细胞液中鸡血细胞液中DNADNA的粗提取实验流程图的粗提取实验流程图 19 7 7、加冷酒精使、加冷酒精使DNADNA析出（纯化）析出（纯化） 冷酒精冷酒精 鸡血细胞液中鸡血细胞液中DNADNA的粗提取实验流程图
13、的粗提取实验流程图 20 DNA的鉴定 21 DNA的粗提取与鉴定 实验原理 DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同 DNA与其他细胞成分在酒精中溶解度不同 DNA和蛋白质对酶、高温和洗涤剂耐受性不同 DNA与二苯胺呈现蓝色反应 DNA粗提取 选择适宜材料破碎细胞 DNA的溶解和析出 DNA的纯化 鉴定DNA 与二苯胺混合，沸水浴，呈现蓝色反应 总结：总结： 22 方法步骤 加入物质 目的 1.制备鸡血细胞液 柠檬酸钠溶液 2.提取鸡血细胞细胞核物质 20 m1蒸馏水 3.溶解细胞核内的DNA 2 mo1 L 的 NaCl 溶液 40 mL 4.析出含DNA的黏稠物 蒸馏水 5.滤取含DNA
14、的黏稠物 6.将DNA的黏稠物再溶解 2 molL 的NaCl溶液20 mL 7.过滤含DNA的NaCl 溶液 8.提取含有杂质较少的 DNA 冷却的95的酒精50 mL A:(1)向试管中加入2molL 的NaCl溶液5mL (2)加入DNA (3)4 mL二苯胺试剂 9.DNA的鉴定 B:(1)向试管中加入 2mol L 的NaCl溶液5mL (2)4 mL 二苯胺试剂 23 加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固 加速血细胞破裂 溶解DNA 使2mol/L的NaCl溶液稀释至0.14mol/L使得DNA 最大限度地释出 使含DNA的黏稠物被留在纱布上 使含DNA的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中
15、 除去含DNA的滤液中的杂质 提取DNA A出现蓝色 B无变化 24 DNA的粗提取与鉴定 一、实验原理 1.血细胞在蒸馏水中会渗透吸水过度而导致细胞膜和细 胞核膜的破裂。利用此特性可得到含有DNA的溶液。 2.DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度 的变化而改变的。DNA在物质的量浓度为0.14 molL 的氯化钠溶液中的溶解度最低，利用这一原理，可以使 溶解在氯化钠溶液中的DNA析出。 3.DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些物质则可以溶 于酒精。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少 的DNA。 4.DNA遇二苯胺（沸水浴）会变成蓝色，因此，二苯胺 可以作为鉴定DNA的试剂。
16、 25 二、方法与过程 1.制鸡血细胞液（活鸡鲜血经分离或沉淀获得） 0.1g/mL柠檬酸钠100mL 活鸡鲜血180mL 500mL烧杯中，玻棒搅拌， 离心、分离或静置沉淀。 2.提取DNA 取血细胞5-10mL20mL蒸馏水，用玻棒沿一个方向 快速搅拌。 纱布过滤：滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质。 原理：血细胞的细胞膜、核摸吸水胀破，玻璃棒快速 搅拌，机械加速血细胞破裂。 .提取血细胞核物质： .溶解核内的DNA： 滤液2mol/L的NaCl溶液40mL，玻棒沿一个方向 轻缓搅拌。 26 .析出含DNA的粘稠物： .滤取含DNA的粘稠物： . DNA粘稠物的再溶解： 在上述溶液中缓缓
17、加入蒸馏水，并沿一个方向轻 轻搅拌，出现丝状物；当丝状物不在增加时，停止加 水（此时NaCl溶液的浓度相当于0.14mol/L）。 用多层纱布过滤，含DNA的粘稠物留在纱布上。 20mL 2mol/L的NaCl溶液 步骤含DNA的粘稠物 在20mL烧杯中轻缓搅拌 3min，使尽可能多的 DNA溶解在NaCl溶液。 .过滤含有DNA的NaCl溶液： 用放有两层纱布的漏斗过滤步骤所得的溶液， 滤液中含有DNA。 27 .提取含有杂质较少的DNA： 步骤所得的滤液体积分数为95%的冷却酒精 50mL，用玻棒沿一个方向轻缓搅拌，溶液中（析出） 出现乳白色丝状物，用玻棒将丝状物卷起，并用滤纸 吸取上面的
18、水分。 3.DNA的鉴定： 加入二苯胺试剂4mL，用玻棒搅拌使DNA溶解， 沸水浴5min，观察溶液是否出现蓝色。 1.共有“三次过滤，两次析出，七次搅拌” 2.加入“两次蒸馏水，三次NaCl溶液，一次酒精” 三、实验小结 28 练习 1、请解释提取DNA的实验操作中主要的步骤的目的。 答：提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是 一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于 实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第 二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否 的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；第三 步是DNA的纯化，即根据DNA的溶解特性、对酶 及高温的耐受性的不同等特性，
19、最大限度地将DNA 与杂质分开；最后一步是对DNA进行鉴定，这是对 整个实验的结果的检测。 29 2、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与 提取DNA一样容易吗？ 答：提取蛋白质比提取DNA的难度大。这 是因为，与DNA相比，蛋白质对温度、盐 浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活 ；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化 性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一 种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特 性摸索提取的条件，设计特定的方法。 30 2.实验中NaCl的物质的量浓度为2 molL和 0.14 molL对DNA有何影响? 1.在DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯 中加入蒸馏水的作用是( )。
20、 A.稀释血液、冲洗样品 B.使血细胞破裂、降低NaCl浓度使DNA析出 C.使血细胞破裂、增大DNA溶解量 D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA B 答：前者是溶解DNA，后者是使DNA析出 31 3.DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成( ) A.砖红色 B.橘黄色 C.紫色 D.蓝色 4.提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液 中的上清液? 答：DNA的提取，关键是对杂质的去除，由于 上清液是血液中的血浆部分，不含DNA，所以 要除去上清液(含有蛋白质)。 D 32 DNADNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定 1 一、基础知识一、基础知识 （一）提取（一）提取DNADNA的方法的方法 1 1
21、、提取生物大分子的基本思路、提取生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理 或化学性质的生物大分子或化学性质的生物大分子 2 2、提取、提取DNADNA的基本思路的基本思路 利用利用DNADNA与与RNARNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性、蛋白质和脂质等在物理和化学性 质方面的差异，提取质方面的差异，提取DNADNA，去除其他成分，去除其他成分 2 3 3、DNADNA的溶解性的溶解性 DNADNA和蛋白质等其他成分和蛋白质等其他成分在不同浓度的在不同浓度的NaClNaCl溶液溶液 中溶解度不同中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的
22、盐，利用这一特点，选择适当的盐 浓度就能使浓度就能使DNADNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者充分溶解，而使杂质沉淀，或者 相反相反 3 根据根据DNADNA在在NaClNaCl溶溶 液中的溶解度曲线液中的溶解度曲线 图，思考在什么浓图，思考在什么浓 度下，度下，DNADNA的溶解度的溶解度 最小？最小？ DNADNA在在NaClNaCl 溶液中的溶解度是溶液中的溶解度是 如何变化的如何变化的？ DNA在NaClNaCl溶液中的溶解度曲线图溶液中的溶解度曲线图 在NaCl溶液浓度低于 0.14 mol/L时，DNA的溶 解度随NaCl溶液浓度的 增加而逐渐降低；在 0.14 mol/L时，DNA
23、溶解 度最小；当NaCl溶液浓 度继续增加时，DNA的溶 解度又逐渐增大。 如何通过控制如何通过控制NaClNaCl溶液溶液 的浓度使的浓度使DNADNA在盐溶液中在盐溶液中 溶解或析出？溶解或析出？ 当氯化钠的物质的量浓 度为 2 molL时，DNA 的溶解度最大，浓度为 014 molL时，DNA的 溶解度最低。利用这一 原理，可以使DNA在盐溶 液中溶解或析出。 4 DNADNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质 则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNADNA 与蛋白质进一步分离与蛋白质进一步分离 4 4、DNA
24、DNA在酒精溶液中的溶解性在酒精溶液中的溶解性 5 5、DNADNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性对酶、高温和洗涤剂的耐受性 蛋白酶能水解蛋白质，但是对蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNADNA没有影响没有影响 大多数蛋白质不能忍受大多数蛋白质不能忍受60608080的高温，而的高温，而 DNADNA在在8080以上才会变性以上才会变性 洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和 蛋白质蛋白质, ,但对但对DNADNA没有影响没有影响 5 6 6 6、DNADNA的鉴定的鉴定 DNADNA与与二苯胺（沸水浴）二苯胺（沸水浴）会染成会染成蓝色蓝色，因此，因此， 二苯胺可
25、以作为鉴定二苯胺可以作为鉴定DNADNA的试剂的试剂 7 二、实验设计二、实验设计 （一）实验材料的选取（一）实验材料的选取 1 1、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血 、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠 菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选 取取2 23 3种实验材料）种实验材料） 2 2、原则：凡是含有、原则：凡是含有DNADNA的生物材料都可以考的生物材料都可以考 虑，但选用虑，但选用DNADNA含量相对较高的生物组织，成功含量相对较高的生物组织，成功 的
26、可能性更大的可能性更大 8 动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中 加入一定量的蒸馏水加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻璃棒搅拌，同时用玻璃棒搅拌， 过滤后收集滤液即可过滤后收集滤液即可 （二）破碎细胞，获取含（二）破碎细胞，获取含DNADNA的滤液的滤液 1 1、动物细胞、动物细胞 答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体， 水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再 加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂 ( (细胞膜和核膜的破裂细胞膜和核膜的破裂) )，从而释放出，从而释放出DNADNA 讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 9 植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解 细胞膜细胞膜 2 2、植物细胞、植物细胞 讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？ 答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜 ，有利于，有利于
