1、DB65 CS 11.220 B 41 准标方山巳ETt 区丘AJ口自尔吾维-EE-PH划4新DB 65/T 4149-2018 马嬉疫防控技术规范-E-ETechnical specification for horse syphilis control 昼EE-ZF一tr 2019一01-01实施2018 -12 -01发布发布新疆维吾尔自治区市场监督管理局DB65/T 4149-2018 目IJ= -EEF-F 本标准按GB/T1.1-2009 标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写的要求编制。本标准由新疆农业大学提出。本标准由新疆维吾尔自治区畜牧厅归口。本标准起草单位:新疆农业大学、
2、伊犁出入境检验检疫局。本标准主要起草人:张杨、巴音查汗盖力克、刘世芳、张伟、王盼举、郭庆勇、许正茂、艾日登才次克、谢小婉、王振宝、闻秀秀、张梦圆、吾力江。E f DB65/T 4149-2018 马嬉疫防控技术规范1 范围本标准规定了马婿疫防控技术的术语和定义、诊断、治疗和预防的技术要求。本标准适用于马场(户)、动物诊疗机构、动物防疫防控机构及养马区域(马场)对马嬉疫的防控。2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。马嬉疫Dourine 2.1 马嬉疫是由马嬉疫锥虫CTrypanosoma equiperdum)寄生于马属动物引起的原虫病。主要寄生于病畜的生殖道粘膜、水肿液及短暂地寄生于血液中
3、。2.2 FEE马嬉疫锥虫Trypanosoma equiperdum 马嬉疫锥虫，隶属于原生动物门(Protozoa)、肉足鞭毛亚门CSarcomastigophora)、鞭毛虫总纲(Mastigophora)、动物鞭毛虫纲(Zoomastigophorea)、动体目(Kinetoplastida)、锥体亚目(Trypanosomatina)、锥体科(Trypanosomati dae)、锥虫属CTrypanosoma)的马婿疫锥虫(Trypanosomaquiprdum)。3 诊断3.1 流行病学特点3.1.1 传染源传染源包括潜伏期感染马、隐性感染马、带虫马。3.1.2 传播途径该病主要
4、通过交配传播而感染，一般是由公畜将病原传递给母畜，也可由母畜传递给公畜。人工授精时，器械未经严格消毒也可发生感染。在生产期间患病母畜在分娩或哺乳时偶尔可将病原传递给幼驹。有些马匹感染后暂时不出现明显症状而成为带虫者，常成为主要传染来源。极少数情况下吸血蝇如此或垫蝇可传播该病。因急性病例而引起的平均死亡率可达50%，尤其是成年种公马。3.1.3 易感动物易感动物包括各类马属动物。实验室条件下咕齿类动物如大鼠、小鼠、兔可感染，犬可在实验室条件下感染。3.2 临床诊断DB65斤XXXX-20183.2.1 7J中宾月公马开始为阴茎黯水肿，局部触诊呈面团状，无痛无热，并继续向阴囊及腹下扩展:尿道流出粘
5、液，尿频，性欲旺盛。母马阴唇水肿，阴道流出蒙古液，水肿部亦无热无痛:后期可出现溃荡，溃殇愈合后，留有无色素斑。3.2.2 皮肤丘殇期在生殖系统发生病变后的一个月，在病马的胸、腹和臀部出现无痛的扁平丘莎，圆形或椭圆形，直径5cm15 cm，中央凹陷，周边隆起，常突然出现，称银元莎通常数小时或数天后自行消失:消失后在身体的其他部位可重新出现，莎块较小时局部可见脱毛或色素消失。3.2.3 神经症状期以局部肌肉神经麻痹为主:当腰神经与后肢神经麻痹时，跋行，步态强拘，颜面神经麻痹时，则见唇歪斜，耳及眼险下垂。咽麻痹的出现，则呈现吞咽因难。出现贫血，瘦弱，最后死亡，死亡率可达5070%。3.3 病原学诊断
6、3.3.1 显微镜涂片检查显微镜检查尿道和阴道的分泌物及发生丘莎的组织，其详细的方法见附录A，可以确诊。3.3.2 动物接种诊断接种于公家兔的辜丸实质进行诊断，其详细的方法见附录B可以确诊。3.4 分子生物学诊断根据附录C判定PCR检测结果。rFEE4 治疗常用治疗药物有:a)荼磺苯眈服(商品名:拜尔205);b)硫酸甲基喳畸胶(商品名:硫酸甲醋安锥赛);c)三氮眯(商品名:贝尼尔);d)二氟甲基鸟氨酸:e)氯化氮胶菲睫盐酸盐(商品名:主!、莫林)。-FE 5 预防5.1 卫生管控遇到疫情及时上报，捕杀患病动物是防控该病的关键。在交配过程中注意卫生安全可在很大程度上减少该病的发生。5.2 药物
7、预防EE一2 I? DB65斤XXXX-2018配种季节前，应对公马和繁殖母马进行检疫。对健康公马和采精用的种马，在配种前用药物进行预防注射。可用茶磺苯眈服，三氮眯，臀部深层肌肉注射。5.3 淘汰处理发现病畜，应及时淘汰，以绝后患。5.4 加强饲养管理在未发生过本病的马场，对新调入的种公马和母马，要严格进行隔离检疫。大力发展人工授精，降低该病感染率。5.5 综合防控马嬉疫锥虫病的方案主要从三方面考虑:a)切断病原即消灭马嬉疫锥虫，通过借助早期诊断方法，一经发现患病马匹，除名贵品种可考虑隔离，进行药物治疗，其余患病动物应及时隔离扑杀，以消灭病原:b)从切断传播途径入手，在配种前期，应对易感马匹进
8、行集中检疫，对患病马匹及时隔离淘汰:在配种季节，对配种器械进行彻底消毒，以切断传播途径:c)对患病的种公马，进行及时淘汰处理，保护宿主马匹。rF伫丘-E3 OB65/T XXXX-2018 附录A(资料性附录)马嬉疫锥虫虫体A. 1马嬉疫虫体附见图A.loE 说明:a一组织内马婿疫锥虫虫体C50X);b一组织内马嬉疫锥虫虫体C50X);C一组织内马嬉疫锥虫虫体C50X);d一组织内马嬉疫锥虫虫体C50X)。图A.1马嬉疫锥虫虫体FELf-EKEP EEE一A.2 涂片详细方法A.2.1马嬉疫锥虫在末梢血液中很少出现，因此血液学检查在马嬉疫诊断上的用处不大。检查材料主要z 应采取浮肿部皮肤或丘彦
9、的抽出液，尿道及阴道的粘膜刮取物，特别在粘膜刮取物中最易发现虫体。4 k D865厅XXXX-2018A.2.2采取病料时，浮肿液和皮肤丘莎液用消毒的注射器抽取，为了防止吸入血液发生凝固，可于注射器内先吸入适量的2%拧橡酸纳生理盐水。A.2.3马阴道粘膜刮取物的采取，先用阴道扩张器扩张阴道，再用长柄锐匙在其粘膜有炎症的部位刮取，刮时应稍用力，使刮取物微带血液则其中容易检到锥虫。采取公马尿道刮取物时，应先将马保定，左手伸入包皮内，以食指插入龟头窝中，徐徐用力以牵出阴茎，用消毒的长柄锐匙插入尿道内，刮取病料。A.2.4也可用灭菌纱布，以生理盐水浸湿，用敷料钳夹持，插入公马尿道或母马阴道，擦洗后，取
10、出纱布，洗入无菌生理盐水中，将盐水离心沉淀，取沉淀物检查。注:以上所采的病料，均可加适量的生理盐水，置载玻片上，覆以盖玻片，制成压滴标本检查;也可制成抹片，用姬氏液染色后检查。ErEF丛PZ5 DB65/T XXXX-2018 附录B(资料性附录)试验动物接种B.1 实验动物健康雄性家兔(新西兰兔，购自新疆医科大学)。B.2 病料将病畜的阴道或尿道刮取物与无菌生理盐水混合后及时接种。B.3 接手中马嬉疫锥虫不能接种于多数实验动物，但可将病畜的阴道或尿道刮取物与无菌生理盐水以3:1混合，接种于公家兔的辜丸实质中，每24h接种1次，每个辜丸的接种量为0.2ml。观察家兔的阴囊、阴茎、辜丸以及耳、唇
11、周围的皮肤发生水肿作为判断依据，持续5d10 d。B.4 接种动物病理变化观察如有马婿疫锥虫存在，经1周2周，即可见家兔的阴囊、阴茎、辜丸以及耳、唇周围的皮肤发生水肿，并可在水肿液内检出虫体。-F伽-E说明:a一兔辜丸肿胀(50X);b一兔辜丸肿胀(50X)。图B.1雄性家兔接种马嬉疫锥虫导致辜丸肿大6 DB65灯XXXX-2018附录C(规范性附录)马嬉疫PCR检测方法(参考郑小龙建立的检测方法)C. 1 主要设备、材料和试剂高速冷冻离心机、PCR仪、恒温水浴锅、混匀器、冰箱、移液器(10L、100L、1000L)、吸头(10L、100L、1000L)、PCR反应管。C.2 样品采集、保存采
12、集浮肿部皮肤或丘痪的抽出液，尿道及阴道的粘膜刮取物，提取DNA，-20 oc保存待检。C.3 核酸提取树脂型基因组DNA提取试剂盒购自北京赛百盛基因技术有限公司说明书操作提取DNA;a)将牌经冷冻后分别在研钵中研磨，然后加入1mL的纯化树脂混匀，然后转移入干净的1.5mL 离心管中。颠倒混匀5次-6次。室温下温育3min，期间颠倒混匀一次，5000 r/min离心3s，收集沉淀:b)用1mLGN结合液将纯化树脂悬浮，颠倒混匀，5000 r/min离心3s，收集沉淀:c)用0.5mL漂洗液漂洗纯化树脂两次，颠倒混匀，5000 r/min离心3s，收集沉淀。如果纯化树脂仍然呈现黄色或褐色，重复第3
13、步一次:d)用0.8mL无水乙醇悬浮，装入离心纯化柱，13000 r/min离心1min，倒掉废液收集管中的乙醇，在离心1min，尽量除尽乙醇:e)将纯化柱套入一个干净的1.5mL或2mL离心管中，加入100LTE缓冲液于纯化树脂上(不能粘在管壁上)，室温下放置3min, 13000 r/min离心2min。重复该步骤一次:f)离心管中收集的液体既是洗脱下来的基因组DNA，取2L电泳(1.0%琼脂糖，120 V, 20 min) 检测并目测定量。-200C保存备用。L E C.4 PCR诊断步骤C. 4. 1 特异性引物序列设计上游引物5吁GGGTITATATCAGGTTCATITAT-3。下
14、游引物5-CCCTAATAATCTCATCCGCAGT-3。C.4.2 PCR扩增反应体系及条件的确定PCR反应体系参照不同PCR试剂推荐的配比。PCR反应参数940C预变性5min; 940C变性1min, 560C返火30s, 720C延伸30s, 30个循环72oC延伸10min, 40C保存。同时设计阳性对照(马嬉疫锥虫DNA)、阴性对照(健康组织DNA)和空白对照(无菌双蒸水)。C.4.3 PCR反应产物凝胶电泳及判定结果用1xTAE电泳缓冲液配制1.0%的琼脂糖凝胶(含1001IL荧光染和，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚好没过胶面，将5PCR产物和1L6xLoading buffer混匀后加入样品孔内，电泳时以DL匕E 同DB65斤XXXX-2018Marker 2000作为对照，5 V/cm电泳时间约30min;凝胶成像仪下观察电泳结果，拍照并记录结果。检查到目的条带(电泳斑)送公司测序，详见图C.l。M 1 2 SOObp 2S0bp 说明:M一分子标准质量:1一阳性模板:2一阴性对照。图C.1 PCR ;胶成像检测结果8 丛E E E
