1、 真菌学国家重点实验室 遗传操作和蛋白表达平台 大片段 基因 编辑组装以及生物 合成 技术服务手册 1. 技术简介 现有 的克隆技术使用的 载体在细胞中的稳定性还不够理想 ； 载体中含有包括抗药性基因在内的大肠杆菌质粒序列，不符合生物安全要求 。 在构建载体时由于依赖限制性核酸内切酶，步骤比较繁琐。 酿酒酵母存在高效的同源重组机制，两个 DNA 分子 间 只要有3050bp 长的同源区段就可以准确、有效地进行同源重组 。 利用酵母 质粒重组 系统 ， 营养缺陷型（ A/T/U） 抗性筛 选 标签 ，以及 真核 细胞 表达技术， 可用于 3050kb 大 片段的体外重组 以及 真核 细胞的合成
2、表达， 技术 稳定 且 重组 效率高 。 2. 应用范围 适用于 50kb 以下大片段基因簇的克隆以及在原核、真核细胞的表达。可应用于化合物的合成 基因簇的组装 ， 进而在异源体系（酵母或 模式高等真菌 ）中表达沉默 次级代谢产物 。并进行 药物 开发 研究 、功能材料应用等领域。 3. 表达体系 组装完成的合成大基因簇可在成熟的丝状真菌（ Aspergillus nidulans）表达系统进行表达分析。另外， 本平台 也提供其它丝状真菌表达系统的转化和表达操作，详见下表。 原核表达 大肠杆菌 Escherichia coli BL21 真核表达 毕赤酵母 Pichia 丝状真菌模式种 构巢曲
3、霉 Aspergillus nidulans 粗糙脉孢菌 Neurospora crassa 丝状真菌致病菌 轮枝镰刀菌 Fusarium verticillioides 烟曲霉 Aspergillus fumigatus 黑曲霉 Aspergillus niger 4. 表达检测分析 应用 HPLC对筛选得到的阳性克隆和阴性对照组进行代谢产物的对比分析，对特异性化合物 应用 HPLC-MS 对其进行结构分析。 GC-MS 可对脂溶性挥发性物质进行 检测 分析。 5. 重组 表达 时效 非特殊情况， 两周内可完成克隆重组，第四周完成真核细胞表达。多个克隆 表达可 同时 进行 。 6. 技术流程
4、 7. 技术 手册目录 1. 大片段克隆酵母重组技术 1.1酵母重组质粒构建 1.2酵母感受态细胞制备 1.3转化酵母感受态细胞 1.4酵母 质粒的提取制备 2. 大肠杆菌 E.coli转化扩增 2.1化学感受态细胞制备 2.2感受态细胞的热激法转化 2.3电转感受态细胞制备 2.4电转化 方法 2.5质粒 基因抽提并检测是否获得转化子 3. 原核 细胞转化以及表达 4. 真核细胞转化以及表达 4.1烟曲霉 Aspergillus nidulans 的原生质体制备及转化 4.2粗糙脉孢菌 Neurospora crassa 电转化 4.3轮枝镰刀菌 Fusarium verticillioides 的原生质体制备及转化 4.4烟曲霉 Aspergillus fumigatus 的原生质体制备及转化 4.5黑曲霉 Aspergillus niger 电转化方法 5. 表达产物检测分析 5.1高校液相色谱（ HPLC） 分析 检测 5.2气相色谱（ GC） 分析 检测
