1、项目名称：上皮组织的形成、更新及其调节机理首席科学家：朱学良 中国科学院上海生命科学研究院起止年限：2012.1至2016.8依托部门：中国科学院一、关键科学问题及研究内容拟解决的关键科学问题： 本项目希望解决的关键科学问题是上皮组织的形成、维持、再生的机理及其与疾病的关系。由于上皮组织的多样性和形态、结构的复杂性，我们将针对上皮组织的特点，以乳腺、肝脏、气管的上皮组织为对象，重点探究以下几方面的问题：（1） 微环境和信号通路怎样调节乳腺等上皮组织的干细胞的自我更新与分化？（2） 能否通过转分化获取人类肝类似细胞（iHep）并实现其在肝脏中的组织重建，突破肝脏再生医学研究中自体种子细胞来源的瓶
2、颈？ （3） 上皮组织细胞（包括干细胞）极性分裂的机理，以及极性分裂怎样调节干细胞命运和组织形成？（4） 纤毛上皮细胞定向分化机理、功能及相关疾病？（5） 上皮组织的EMT与细胞迁移的调节机理及其在组织形成和修复中的作用？（6） 上述生命过程与癌症发生发展的关系？主要研究内容：（一）上皮组织干细胞的维持、自我更新与分化的机理1. 探索Wnt等信号通路及微环境调控乳腺上皮干细胞维持和自我更新的机理，以及对气管上皮干细胞分化的调节机理；2. 解析Hpo信号下游效应分子对上皮干细胞增殖和维持的调控机制，鉴定Hpo与其它重要信号通路的相互作用蛋白网络；3. 研究细胞极性调节因子对肝上皮组织形成和病变的
3、作用；4. 研究iHep的形成机理并探索高效获得功能性的人类iHep的关键技术。（二）上皮组织细胞极性分裂的调节机理1. 研究极性细胞分裂中纺锤体定向的调节机理及功能；2. 研究不对称分裂过程中肌球蛋白极性分布的分子机制； 3. 探索调节胞质不均等分裂的重要信号分子；4. 探讨细胞分裂的异常与癌症发生的关系。（三）纤毛化上皮细胞的分化机理及功能1. 深入研究影响纤毛化上皮细胞分化的新基因的功能和信号通路的作用机理； 2. 鉴定鞭毛组装、解聚以及长度控制的相关基因，并深入研究其功能和作用机理；3. 探索Shh信号通路组分在纤毛中运输的机制及其与功能的关系； 4. 探讨纤毛分化和功能异常与癌症和其
4、它疾病的的关系。（四）上皮组织细胞EMT与迁移的调节机理1. 探索极性蛋白质在EMT、上皮细胞迁移和癌变等过程中的功能及作用机理；2. 研究NudC/LIS1/Dynein通路在上皮细胞迁移中的功能、作用机理及其与癌症发生发展的关系；3. 解析上皮组织损伤修复的机理及其与癌症等疾病的关系。二、预期目标（一）总体目标整合国内在该研究领域已做出优秀成绩的研究单位和科学家，综合利用多种模式生物和研究系统，从分子、细胞、组织和个体等层面聚焦上皮组织的形成、更新及调节机理这一生命科学领域的重要问题，通过深入系统地研究，做出一序列重要的科学新发现，以阐明上皮组织干细胞维持、自我更新和分化的调节机理，阐明极
5、性分裂的调节机理和功能，揭示干细胞向纤毛细胞定向分化的机理和相关生理功能，明确上皮组织细胞EMT与迁移的调节机理及功能。深入认识促进癌症发生发展的新机制以及纤毛相关疾病的新的致病机理，为这些疾病的防、诊、治提供理论依据和分子靶标。而且，发展乳腺干细胞体外培养方法、人类成纤维细胞转分化获取自体肝细胞的方法，以及多种类型的纤毛细胞的诱导分化方法，为我国的再生医学研究提供重要的拥有自主知识产权的技术和手段。同时，打造一支具有国际先进水平的上皮组织生物学研究队伍，培养一批优秀的青年研究骨干。（二）预期目标1. 揭示Wnt信号通路、Hippo信号通路、极性维持信号通路对乳腺等来源的上皮干细胞维持、自我更
6、新和分化的调控新机理；2. 阐明有丝分裂激酶及其底物、细胞骨架相关蛋白等调节包括干细胞在内的上皮组织细胞分裂中有丝分裂纺锤体定向的分子机理，认识这些过程的异常与癌症发生发展的关系；3. 揭示调节上皮干细胞向纤毛细胞定向分化的重要蛋白质和信号通路的功能、作用机理及与疾病的关系；深入认识纤毛依赖性的信号转导通路的调节机理与功能； 4. 揭示极性蛋白质复合物、NudC/Lis1/dynein通路和TLR通路等在上皮组织EMT、细胞迁移和损伤修复中的调控新机理，展示这些过程间的内在联系，以及与癌症发生发展的关系，为临床诊断和治疗提供标记物、潜在的药物靶点和基础理论支持；5. 建立完善的乳腺干细胞体外培
7、养技术，发展高效产生人类iHep细胞和多种纤毛细胞的关键技术和方法，为再生医学研究提供新的自体种子细胞来源；6. 研究成果主要以研究论文和独立开发的技术成果（专利）形式公布，五年内争取发表SCI论文50-60篇，其中在影响因子大于5的杂志上发表论文30-50篇，在影响因子大于10的杂志上发表5-15篇论文，申报专利5-10项；7. 培养一批在上皮组织和细胞生物学领域具有国际竞争力的优秀中青年科学家和后备人才，造就一支结构合理、具备攻坚能力的国际先进水平的研究队伍。五年内预期培养博士和硕士研究生40-60人，青年骨干8-10名，国家杰出青年科学基金获得者等高级人才2-5名。三、研究方案（一）、学
8、术思路上皮组织的形成与更新涉及上皮干细胞的维持、增殖及定向分化、上皮细胞的极性形成、胞间连接的建立、EMT和细胞迁移等环节，任何环节的错误都可能导致上皮组织形态、结构和功能异常，进而导致多种疾病的发生。结合国际前沿的研究进展和国内的优势，我们选择了其中意义重大而且可能取得重要突破的四个方面的问题作为本项目的主要研究内容（见示意图）。其中，干细胞的维持和自我更新是上皮组织形成和更新的基础，其机理研究主要从微环境和信号转导的角度进行。细胞极性分裂是上皮组织细胞分裂的特色，关乎干细胞自我更新和分化命运的调节，而且也为组织形成和更新所必须，与第一部分关系紧密，但需要从纺锤体定向和细胞分裂的调节机理等方
9、面入手。第三部分利用纤毛上皮细胞高度特化、功能多样、分布广泛，而且与疾病关系密切的特点，将其作为代表性的细胞类型，深入研究上皮干细胞定向分化的机理，以认识上皮组织形成和更新过程中调节细胞类型多样性的机制。第四部分则探讨EMT这一上皮组织细胞特有的变化以及细胞迁移的调节机理，这些细胞活动在干细胞分化、组织形成和损伤修复中有重要功能，而且与癌症转移关系密切。事实上，上皮组织细胞只有在细胞核迁移（也称转位）到顶端(apical side)后才能进入分裂期；至少神经上皮中神经干细胞分化时需要经历EMT，而分化的神经细胞则必须要迁移出神经上皮。因此，这四部分之间联系紧密、相辅相成，缺一不可（见示意图）。
10、又如，项目组成员曾艺研究员证明，单个的乳腺上皮干细胞在小鼠脂肪垫中可以再生出完整的乳腺。在此过程中，干细胞需要通过极性分裂自我更新并维持一定的数目，并分化成各种乳腺上皮细胞，形成管腔结构，还需要不断迁移、延伸、分叉，最终形成网状的乳腺。因此我们拟通过这些方面的研究，深入认识上皮组织形成、更新的调控机理，及其在生理、病理情况下的变化。考虑到上皮组织的多样性和复杂性，我们将以乳腺、肝脏、气管等的上皮组织为主要研究对象，结合体内外的研究系统并充分利用衣藻、果蝇、线虫、斑马鱼、小鼠等模式生物各自的优势，从分子、细胞、组织和个体等多个层次开展研究。希望一方面产出重要的研究新发现，推动人类的知识进步和该领
11、域的发展；另一方面，在上皮干细胞维持与更新、特定上皮细胞的定向分化和转分化等方面的技术和知识可望促进我国组织工程和再生医学的研究与应用，而包括癌症在内的上皮组织相关疾病方面的研究成果则有助于疾病的诊断和治疗，为提高国民的健康和生活质量做出贡献。学术思路示意图上皮组织干细胞的维持与自我更新的机理纤毛上皮细胞的分化机理及功能上皮组织细胞分裂的调节机理上皮组织的形成、更新及其调节机理上皮组织细胞EMT和迁移的机理（二）、技术途径本项目拟在分子、细胞、组织和个体水平等多个空间尺度上研究上皮组织的形成、更新及调节机理。在分子水平利用免疫共沉淀、免疫印迹等手段研究信号信号转导和细胞活动中的蛋白质-蛋白质相
12、互作用和上下游关系；在细胞水平利用激光共聚焦(laser confocal)、激光转盘(laser spinning-disc)共聚焦、荧光缩时(fluorescence time-lapse)等显微镜技术研究细胞分裂、分化、迁移和EMT等活动；在组织水平利用单光子或多光子活体显微示踪和各种组织学技术关注细胞-细胞相互作用、组织结构特征、组织形成与更新等；在个体水平，则利用敲低(knock-down)、基因敲除(knockout)和转基因等手段在小鼠、斑马鱼、线虫、果蝇、衣藻等模式生物中进行在体的机理和疾病模型研究。这几个层次也是互为依托的。总体技术途径如下图：干细胞纤毛细胞分化极性分裂分子水
13、平个体水平上皮组织的形成、更新及其调节机理癌症和纤毛疾病细胞水平总体技术途径示意图乳腺、肝脏、气管等上皮组织组织水平EMT和细胞迁移（三）、创新点与特色1. 上皮组织在多细胞生物体内发挥重要的功能，其形成、更新及调控机制是当前生命科学领域的国际前沿和热点问题，因此，本项目从选题上保证了创新性。而且，研究内容充分兼顾了重要科学问题与前期工作基础，以实现高起点和高目标的完美结合；2. 通过体内和体外，分子、细胞和个体水平的紧密结合，综合利用多种模式生物，从多个层次和多个角度进行上皮组织形成、更新及调节机制及与疾病关系的研究，是本项目在技术路线方面的特色；3. 多学科联合攻关和多研究手段综合运用也是
14、本项目的一大特色。本项目重点针对上皮组织形成和更新中的关键科学问题，组建了包括发育生物学、细胞生物学、遗传学、基础医学等多学科结合和交叉的优秀研究队伍，所设置的课题相互渗透、紧密联系，可相互借鉴与互补，并有利于综合运用多种最新的技术和研究手段；4. 从国家需求来看，上皮组织的异常会导致癌症等严重危害人类健康的重大疾病。所以，本项目的研究可望促进新的疾病诊断方法的建立和药物靶标的发现，而在上皮干细胞维持、特定上皮细胞的定向分化和转分化等方面的技术和知识可望促进我国组织工程和再生医学的研究与应用，为提高国民的健康和生活质量做出重要贡献。（四）可行性分析1. 本项目的总体研究方案切实可行从学术思路上
15、看，本项目紧扣上皮干细胞的维持、自我更新及定向分化、上皮细胞的极性分裂与细胞命运决定、细胞粘附与迁移等上皮组织的形成与更新所涉及的关键环节，以及癌症等上皮组织特异性的疾病，集中了国内的优势研究力量，以乳腺、肝脏、气管的上皮组织为主要研究对象，结合体内外的研究系统并充分利用衣藻、果蝇、线虫、斑马鱼、小鼠等模式生物各自的优势。这一设计和安排符合重大专项指南的要求，并有利于国内优势研究方向的发展和重要研究突破的取得。从技术途径上看，本项目所涉及的基本技术，包括各种细胞成像技术、模式生物基因操作技术、细胞移植技术、免疫共沉淀技术、串联亲和层析/定量质谱分析等都是成熟的技术。四个具体研究课题的技术途径和
16、路线清晰、明确。当然，生命的复杂性也决定了任何的研究方案都不可能尽善尽美，也难以完全按部就班地进行。因此，能否取得重要研究发现甚至突破的关键还是在于研究团队的水平和在探索未知的过程中不断发现、分析、解决问题能力。2. 本项目凝聚了优秀的研究团队科学发现与研究队伍的素质密切相关。本项目凝聚的优秀研究团队，确保了研究的顺利实施。研究队伍中有国家基金委创新团队负责人1名、“国家杰出青年基金”获得者3名、中科院“百人计划”入选者7名、教育部“长江学者”1名、3位教育部“新世纪优秀人才支持计划”获得者。项目组成员已经承担或完成多项相关的研究课题，其中包括国家“十五”科技攻关计划课题、科技部“973”项目
17、、科技部“863”项目、国家自然科学基金重点项目、国家杰出青年基金、国家自然科学基金委“优秀创新群体”项目等。具有实施国家级重大/重点项目顺利的丰富经验。 推荐的首席科学家朱学良研究员是国家杰出青年基金获得者和中科院“百人计划”入选者，承担过/着科技部“973”项目研究组长、基金委“优秀创新团队”学术带头人、中科院“重要方向性项目”首席科学家和“国际合作伙伴计划”中方协调人、中科院“分子细胞生物学重点实验室”主任等学术职务，具有较高的学术水平和较强的组织协调能力。3. 本项目成员具有扎实的前期工作基础本研究团队的成员在发育、分化、干细胞生物学、细胞分裂、细胞迁移和纤毛发生的分子机制方面有着扎实
18、的研究基础和突出的实力。如果以SCI影响因子作为参考的话，2005年来项目组成员已经作为通讯作者/第一作者在Cell、Nature和Science等影响因子10以上的杂志发表研究论文17篇，影响因子介于5和10之间的发表39篇。4. 良好的工作条件和环境为本研究项目顺利实施提供了保障本项目的依托、承担单位（中国科学院上海生命科学研究院、中科院生物物理所、清华大学、南开大学、浙江大学等）属于国内一流的科研院校，有很强的综合科研实力。大部分科研骨干都依托于多个国家级和省部级重点实验室，包括生物大分子国家重点实验室，中国科学院分子细胞生物学、营养科学重点实验室、教育部生物活性材料、蛋白质科学、恶性肿
19、瘤预警与干预重点实验室等。这些科研单位及所依托的重点实验室为本项目的开展提供了良好的工作环境和条件。本项目的依托、承担单位及项目骨干的实验室拥有优秀的软硬件设施，包括开展分子生物学、细胞生物学、蛋白质组学等研究的相关仪器设备、研究平台，以及线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠等模式动物的饲养条件；建立了成熟的实验方法，包括免疫荧光组织化学技术、激光共聚焦显微镜术、电镜技术、活细胞成像技术、流式细胞分析技术、分子原位杂交技术、酵母双杂交系统、免疫共沉淀技术、动物模型制备、蛋白质肽谱分析、转基因动物制备和基因敲除技术等。（五）、课题设置课题一 上皮组织干细胞的维持与自我更新承担单位：中国科学院上海生命科学研究
20、院课题负责人：惠利健研究员 （中国科学院上海生命科学研究院）学术骨干：曾艺研究员（中国科学院上海生命科学研究院） 张雷研究员（中国科学院上海生命科学研究院） 张喆副研究员 （中国科学院上海生命科学研究院）经费比例：24.33%研究目标：揭示微环境和重要的信号通路对乳腺等来源的上皮组织干细胞维持、增殖和分化的调控新机理；建立在体外高效诱导功能性的人类肝脏上皮细胞(iHep)的关键技术，为肝脏疾病的再生医学研究提供新的自体来源的种子细胞来源。主要研究内容：1. 探索Wnt等信号通路及微环境调控乳腺和气管上皮干细胞自我更新和分化的机理1) 利用细胞表面分子标记（Lin-, CD24+, CD29hi
21、），通过流式细胞技术分离乳腺干细胞和祖细胞；在乳腺干细胞和祖细胞体外培养体系分别加入纯化的Wnt3A蛋白和对照。从培养后的细胞提取RNA，利用基因芯片技术，通过表达图谱对比分析这两组培养条件下乳腺干细胞和祖细胞的基因表达，找出在添加Wnt3A的条件下仅在干细胞中表达升高的基因，作为决定乳腺干细胞多能性的候选基因；2) 在乳腺干细胞体外培养体系用慢病毒感染介导shRNA，敲低候选基因的功能，观察其是否影响体外连续传代的克隆形成。将敲低了候选基因的干细胞移植到受体小鼠，观察其是否能够重建乳腺器官。由这些实验结果决定出候选干性基因。在干细胞中过表达候选干性基因，观察其在受体小鼠的乳腺再生能力及发生癌
22、变的几率是否提高；3) 构建小鼠模型，在体内进一步检验干性基因在体内的功能。通过小鼠胚胎干细胞转染和囊胚显微注射，构建干性基因的条件性缺失小鼠模型。在正常发育中系统地验证干性基因对乳腺发育的影响。建立候选基因启动子的CreER小鼠模型，lacZ标记，并跟踪这些干细胞的后代细胞的生长和分化。同时建立荧光示踪小鼠的打靶质粒。不仅可以对干细胞进行体内示踪，而且可以通过流式分选获得纯化的乳腺干细胞；4) 确定Wnt信号通路在小鼠气管上皮干细胞分化中的功能，并明确是经典还是非经典Wnt信号通路发挥作用。通过敲低或过表达Wnt通路中的重要基因，以及小分子抑制剂和激活剂，深入研究Wnt通路在气管上皮干细胞分
23、化中的作用机制,并探讨Wnt信号通路与其它重要信号通路之间的网络。2. 解析Hpo信号上、下游效应分子对上皮干细胞增殖和维持的调控机理，鉴定Hpo与其它重要信号通路的相互作用蛋白网络1) 通过已有的Hpo通路相关的遗传学筛选和蛋白与蛋白相互作用的筛选结果，全基因组水平鉴定Hpo通路参与上皮组织增殖、发育调控的重要因子；2) 研究介导Yki/Yap活性的Sd/TEAD转录因子的靶基因，找到影响上皮干细胞增殖的其它重要因子；3) 研究不同信号转导通路在上皮干细胞中与Hpo信号通路的相互作用；4) 筛选调控Yki/Yap活性的小分子。3. 利用细胞和小鼠模型研究重要极性蛋白复合物（以Cdc42和Hu
24、gl-1等为代表）对肝上皮细胞极性形成、细胞增殖迁移等生物学行为的调控作用，及其对肝脏多种生理病理过程的影响及机理 1) 从分子水平阐明Cdc42对肝细胞极性及肝组织结构所产生的影响。检测肝脏特异性敲除Cdc42（KO小鼠或用病毒急性敲除Cdc42）对肝细胞极性及肝组织结构所产生的影响，以及对肝细胞内重要极性相关蛋白细胞内定位的影响；2) 对小鼠肝细胞极性异常与肿瘤发生的机理探究。研究Cdc42对肝细胞增殖、凋亡以及转化成瘤能力的调控，及其对相关生长信号通路影响；在小鼠的原代肝细胞中观察Cdc42对细胞极性的影响；寻找受Cdc42 基因敲除影响的蛋白，并选择其中有代表性的候选蛋白进行进一步的机
25、理研究；3) Cdc42调控的小鼠肝细胞极性在胆汁酸平衡，肝脏急性损伤中的作用及机理；4) 通过建立Hugl-1缺失或高表达（在肝癌中发现的典型突变体）细胞模型，观察研究野生型及各种突变体在传统培养条件及三维培养下对细胞的生长，增殖，运动，分化，粘附及凋亡等生命活动的影响，以了解Hugl-l突变对细胞极性与增殖迁移的作用；5) Hugl-1蛋白复合物的结合蛋白的蛋白质组学分析。从中寻找Hugl-1调控细胞极性及细胞增殖、迁移的分子机制。4. 探索通过人类成纤维细胞转分化直接获得具有功能的肝脏上皮细胞的关键技术，为再生医学提供新的种子细胞来源 1) 研究转分化的分子调控机制。研究小鼠成纤维细胞细
26、胞转分化为肝脏上皮细胞过程中，DNA损伤途径及ROS对细胞类型转换的抑制作用及具体分子机制；2) 收集不同年龄段的人类皮肤样品，建立人类皮肤原代成纤维细胞培养系统；3) 筛选诱导人类皮肤成纤维细胞转分化为iHep细胞所需转录因子。根据已有研究报道，选定在人类肝脏发育或者功能中发挥重要作用的转录因子。将候选转录因子通过慢病毒系统在人类皮肤成纤维细胞中表达。通过形态学观察和免疫细胞化学染色来确认是否在诱导转分化的培养中产生具有上皮细胞特点的克隆。其次用RT-PCR、免疫荧光和ELISA的方法检测Albumin等肝特异表达基因是否在这些细胞中表达。最后采用PAS染色的方法来检验这些细胞中是否有糖原生
27、成。这些检测将被用于初步筛选是否可以重编程人类皮肤成纤维细胞为iHep细胞；4) 人类iHep细胞其体外功能验证。计划用人类原代肝细胞和以下几个检测来进行体外功能验证。为了验证iHep细胞的解毒功能及代谢外源化合物的能力，我们会采用HPLC-MS-MS验证iHep细胞类似细胞的CYP450功能；为了验证iHep细胞的氮代谢功能，采用尿素酶法检验iHep合成尿素的能力；为了验证iHep细胞的脂代谢功能，采用DIL-acLDL显色检验iHep吸收acLDL的能力等等；5) iHep细胞的体内功能验证。为验证iHep类似细胞的体内功能，我们计划用有酪氨酸代谢缺陷的fah-/-小鼠来进行肝细胞重建实验
28、，确定人类iHep细胞是否可以重建60%80%的fah-/-/Rag2-/-/Il2Rg-/-小鼠肝脏，并保持正常的肝功能，从而达到治疗这些具有代谢疾病小鼠的目的。并分析iHep细胞体内成瘤的风险。课题二 上皮组织细胞的极性分裂承担单位：南开大学、中国科学院生物物理研究所 课题负责人：周军教授 （南开大学）学术骨干：欧光朔研究员（中国科学院生物物理研究所）苗龙研究员 （中国科学院生物物理研究所）经费比例：23.67%研究目标： 阐明包括干细胞在内的上皮组织细胞分裂中极性形成、维持、重建和有丝分裂纺锤体定向的分子机理，揭示它们与细胞命运决定、组织结构形成的关系，明确这些过程的异常与癌症发生发展的
29、关系。主要研究内容：1. 微管骨架相关蛋白调节上皮组织细胞分裂的机制纺锤体微管尤其是星体微管，通过与细胞皮层的相互作用，调节纺锤体定向和细胞极性分裂。细胞内的微管相关蛋白通过与微管的协调作用或通过调节微管的组装和动态性，在细胞分裂中发挥重要作用。我们将通过激光共聚焦显微分析和实时荧光显微分析等手段，并利用动物模型，研究CYLD等微管相关蛋白对纺锤体定向的调节及相关的分子机制，并探讨微管相关蛋白的修饰对其调节细胞分裂功能的影响。另外，分析微管相关蛋白对纺锤体形成和染色体分离等过程的调节，研究这些蛋白对纺锤体微管的组装和稳定性的精细调控，以及对极性相关蛋白在细胞内定位的调节等。2. 有丝分裂激酶及
30、其底物调控纺锤体定向的分子机制染色体与纺锤体相互作用的可塑性及动力学特征是上皮组织细胞分裂的保证。Aurora和PLK1家族有丝分裂激酶通过调节染色体与纺锤体相互作用，在有丝分裂的进入、中心体成熟和纺锤体形成等过程中发挥重要的功能。我们将围绕Aurora A、PLK1等有丝分裂重要激酶展开系统研究，阐明这些激酶及其底物与中心体蛋白质群及微管相关蛋白等相互作用调控纺锤体定向和染色体运动的分子机制，评估这些激酶磷酸化调控的动力学特征及效应机制，并应用特异性小分子抑制剂评估蛋白质磷酸化修饰对纺锤体定向可塑性及有丝分裂均等性调控的分子机制。3. 线虫细胞不对称分裂过程中肌球蛋白极性分布的分子机制肌球蛋
31、白的不对称性对上皮细胞的不对称分裂和极性建成有重要的调节作用。我们将检验蛋白激酶PIG-1和经典的细胞极性信号转导通路组分（par-1, par-3, par-4 和par-6等基因）在Q神经母细胞不对称分裂中的作用，寻找潜在的下游基因并研究它们的功能。进行线虫的EMS化学诱变，系统地筛选在Q细胞不对称分裂中起关键作用的蛋白质，观察它们在Q细胞不对称分裂中的亚细胞定位，利用活体成像技术追踪它们于细胞内极性分布的动态过程，并检测这些蛋白质与PIG-1激酶的相互作用及功能，从而揭示细胞不对称分裂中调节肌球蛋白极性分布的信号转导通路。4. 细胞减数分裂和极性形成的关键信号通路线虫精子细胞的形成过程是
32、研究胞质不均等分裂及细胞极性建立的良好模型。我们将主要研究线虫精子细胞减数分裂过程中调节物质运输及胞质不均等分裂的重要信号分子，鉴定在减数分裂过程中调控膜细胞器形成和转运的蛋白质及相关的调控途径，分析减数分裂后细胞极性建立及调控型囊泡分泌的机制。在已有的工作基础上，建立SRP:GFP在线虫性腺特异表达的虫株，从而活体观察精子细胞减数分裂过程中SRP蛋白的转运及分配模式，并研究该蛋白对受精后胚胎极性分裂的调控作用。同时，以SRP:GFP为标记分子，筛选并研究影响膜细胞器正确形成及转运的蛋白分子，探讨细胞减数分裂过程中调节物质运输及胞质不均等分裂的信号通路及对精子细胞极性建立的影响。5. 细胞分裂
33、调控异常与疾病的关系微管骨架动态性的异常或染色体与纺锤体微管连接异常可能导致染色体分离的异常，从而使上皮组织细胞分裂的失控，引起肿瘤的发生与发展。我们将通过细胞和分子生物学手段，并利用动物模型和临床样品，分析微管相关蛋白、有丝分裂激酶等重要细胞分裂调节因子的异常对上皮组织细胞分裂的影响，进一步分析这些蛋白的异常在肿瘤发生发展中的作用，包括研究这些蛋白在肿瘤样品中的表达情况，并分析其表达水平与反映肿瘤恶性程度的一些临床病理参数之间的相关性，分析它们对肿瘤细胞增殖、集落形成、小鼠体内肿瘤生长的影响等。课题三 纤毛化上皮细胞的分化与功能承担单位：中国科学院上海生命科学研究院；清华大学；南京医科大学课
34、题负责人：朱学良研究员 （中国科学院上海生命科学研究院）学术骨干：潘俊敏教授（清华大学）程雁教授 （南京医科大学）鄢秀敏副研究员（中国科学院上海生命科学研究院）经费比例：28.33%研究目标： 发现在纤毛化细胞分化过程中的重要功能蛋白质和信号通路，并深入、系统地揭示它们的功能和作用机理及与疾病的关系；深入认识纤毛依赖性的信号转导通路的调节机理与功能；发展高效诱导多种纤毛细胞的方法，为机理研究和再生医学研究提供帮助。主要研究内容：1. 纤毛发生和功能相关基因的筛选、鉴定和功能研究 纤毛化上皮细胞的功能和分化同纤毛具有密切关系，目前已经发现多种遗传疾病与纤毛异常有关，所以筛选和研究纤毛发生和功能相
35、关基因对于深入了解纤毛细胞分化及其相关遗传疾病的分子机理至关重要。我们将首先通过基因芯片的方法，对纤毛上皮细胞不同分化阶段的基因表达谱进行杂交分析，筛选到在此分化过程中基因表达变化显著的基因，并对其进行生物信息学分析，筛选得到带有一定结构域的在纤毛发生中未知功能基因。利用斑马鱼系统，通过注射morpholino的方法，在斑马鱼中敲除相关基因，观察该基因在斑马鱼的早期发育中对纤毛发生或功能的影响，得到对纤毛发生或纤毛功能有重要作用的基因。利用小鼠气管上皮细胞、其它的哺乳动物细胞系和组织，对这些基因的亚细胞定位进行研究，鉴定相应的蛋白质复合物，并深入研究其功能及其作用的分子机理。依据斑马鱼和哺乳动
36、物细胞中的研究结果，对功能重要的基因构建相应的敲除小鼠，深入研究该基因在发育中的功能。最后，根据动物模型的表型，探讨与纤毛相关疾病的关系及其分子机理。 2. 调控纤毛组装、解聚以及纤毛长度的重要基因的鉴定及其功能和分子机理的研究纤毛的发生和解聚影响上皮细胞的分裂和分化。纤毛的存在抑制细胞的分裂，使细胞维持在分化状态，而纤毛解聚则促进细胞的分裂。因此，纤毛的组装、解聚和长度的调控与纤毛化上皮细胞的分化和功能密切相关。基于纤毛和鞭毛的保守性，将利用模式生物衣藻的优势，通过遗传学和比较蛋白质组学等方法，鉴定鞭毛组装相关的基因，阐明它们在衣藻生活周期中鞭毛组装、解聚和长度控制中的功能和分子机理，研究它
37、们在高等动物纤毛上皮细胞中的功能，并着重研究重要蛋白质激酶在纤毛长度调控和解聚的分子机制。3. Shh信号通路组分向纤毛转运的调控机制及其与功能的关系Sonic Hedgehog (Shh) 是脊椎动物中调控组织形态发生和干细胞定向分化的重要形态发生因子。这一通路信号转导紊乱是导致发育畸形与多种肿瘤发生的重要病理因素。在脊椎动物细胞中，纤毛是Shh通路信号转导发生的场所，许多影响纤毛发生的基因突变都会导致Shh信号转导紊乱，乃至引起发育以及机能的病变和肿瘤的形成。因而探明纤毛转运的调控机制对深入理解Shh信号转导及其在胚胎发育和肿瘤发生中的作用有重要的提示性意义。我们将着重研究shh信号通路中
38、的重要分子Sufu在shh信号通路分子的纤毛运输中的作用，鉴定引导Sufu与Gli3复合物向纤毛转运的顺式信号，识别这一信号的受体，以及驱动所需的转运蛋白和分子马达蛋白，并研究Sufu的磷酸化、泛素化及其特异的E3泛素连接酶在纤毛运输中的作用和调控机理，通过构建敲入性小鼠模型阐明该调控机制对shh信号通路在胚胎发育及其不同生理条件下的生理功能和意义。利用RNAi敲低、荧光素报告基因检测与生物影像等方法筛选Rab、Arf和Arl这三个小GTPase家族成员对Shh信号通路分子向纤毛的转运的影响，并对筛选到的候选小GTPase进行功能鉴定与生物学意义研究。课题四 上皮组织细胞的EMT与迁移承担单位
39、：浙江大学、中国科学院上海生命科学研究院 课题负责人：周天华教授（浙江大学）学术骨干：鲁林荣教授（浙江大学）詹丽杏研究员（中国科学院上海生命科学研究院）经费比例：23.67%研究目标：揭示上皮组织中EMT、细胞迁移、损伤修复的调控新机理，展示这些过程间的内在联系，及其与癌症发生发展的关系，为临床诊断和治疗提供标记物、潜在的药物靶点和基础理论支持。主要研究内容：1. 极性蛋白质在EMT、细胞迁移及癌变等过程中的功能及作用机理研究在一般情况下，上皮细胞具有明显极性，细胞极性对上皮细胞行驶正常功能非常重要，在细胞不对称分裂、细胞分化、胚胎发育等众多生物学过程起着关键性的作用。然而，在特定的生理和病理
40、情况下，上皮细胞可以通过上皮细胞-间充质细胞转分化（epithelial-Mesenchymal transitions, EMT），导致细胞与细胞间的连接丧失及顶端-基底极性的缺失，使上皮细胞获得较强的迁移运动能力。多年来的研究发现，EMT不仅在胚胎发育和损伤修复等生理过程中发挥着重要作用，而且还与器官纤维化和上皮肿瘤恶性进展（侵袭/转移）等病理密切相关。我们将运用TGF等EMT regulator触发上皮细胞发生EMT，并结合分子生物学和生物信息学方法，探讨上述EMT过程中细胞极性信号受调控的机制，及其极性蛋白直接间接调控下游信号通路的机制，从而获得EMT过程中控制及维持EMT的经典极性信
41、号通路，以期发现新的EMT标志物及分子阻遏物。另外运用多个上皮细胞研究平台，探讨极性基因调控上皮细胞功能的机制，例如与细胞侵袭和迁移的关系。此外我们也将探讨极性蛋白EMT过程对上皮细胞迁移和癌变等过程的紧密联系，寻找潜在肿瘤治疗靶点。2. 研究NudC/LIS1/Dynein通路在上皮细胞迁移中的功能、作用机理及相关的调节网络，并且结合体内外系统和病理样本探讨它们在癌症发生发展中的作用细胞迁移（cell migration）是细胞运动的基本形式之一，细胞迁移过程涉及到多种生理和病理过程，人们越来越多地认识到其重要性。我们将在分子、细胞、动物模型和临床病人等不同水平，结合多种研究手段，系统研究哺
42、乳类动物NudC/LIS1/Dynein信号通路在上皮细胞迁移运动中的功能和分子机制及其在上皮细胞恶性肿瘤（癌症）发生发展中的作用。在分子水平基本阐明NudC家族成员调控下游蛋白（如LIS1、Dynein中间链及其他蛋白等）的机制，在细胞水平基本了解NudC/LIS1/Dynein通路核心蛋白（包括下述的FOR20和Twa1等）在上皮细胞迁移运动调节中的功能，在整体动物水平（如热带爪蟾、斑马鱼、小鼠等模式动物）基本揭示该通路在模式动物发育过程中的作用，在临床实践中寻找NudC/LIS1/Dynein信号通路与癌症发生发展的关系。3. 解析炎症信号与分子在上皮组织损伤修复与癌变中的作用急性炎症在
43、促进上皮损伤修复中发挥种要作用，而上皮组织的慢性炎症却也能促进上皮细胞的不典型增生和癌变。不同的炎症微环境，会导致炎症细胞产生不同的响应，分泌不同的细胞表面粘附分子和可溶性因子，从而影响上皮细胞的增殖、迁移或转分化。我们将研究炎症细胞在急性炎症和慢性炎症等不同炎症微环境中分泌蛋白质和细胞因子的异同，从而探讨这些不同的关键因子如何在不同的损伤环境中对内皮细胞的损伤修复和癌变产生作用。主要将通过组学的手段鉴定这些关键的因子，并在细胞水平研究其对介导炎症反应、调控EMT及细胞运动的作用和机制。最后利用小鼠动物模型，研究其在上皮组织损伤修复和癌变中的作用。（六）、课题间相互关系根据本项目拟解决的关键科
44、学问题和研究内容，设置了四个课题，分别为：上皮组织干细胞的维持与自我更新（课题1）、上皮组织细胞的极性分裂（课题2）、纤毛化上皮细胞的分化与功能（课题3）、上皮组织细胞的EMT与迁移（课题4）。这四个课题分别针对上皮组织形成、更新和病变过程中不同的重要环节，相互密切交叉、渗透，形成一个有机的整体，以便从不同侧面探索并回答上皮组织的形成、更新的方式、调节机理，以及与癌症等疾病的关系。其中，干细胞的维持和自我更新是上皮组织形成和更新的基础，其机理研究主要从微环境和信号转导的角度进行。细胞极性分裂是上皮组织细胞分裂的特色，又关乎干细胞自我更新和分化命运的调节，而且也为组织形成和更新所必须，与课题1关
45、系紧密，但主要从纺锤体定向和细胞分裂的调节机理等方面入手。课题3则利用纤毛上皮细胞高度特化、功能多样、分布广泛，而且与疾病关系密切的特点，将其作为代表性的细胞类型，深入研究上皮干细胞定向分化的机理，以认识上皮组织形成和更新过程中调节细胞类型多样性的机制。课题4探讨EMT这一上皮组织细胞特有的活动以及与之密切相关的细胞迁移的调节机理：这些细胞活动在干细胞分化、组织形成和损伤修复中有重要功能，而且与癌症转移关系密切。例如，上皮组织细胞只有在细胞核迁移（也称转位）到顶端(apical side)后才能进入有丝分裂期，而至少神经上皮中神经前体细胞分化时需要经历EMT，分化中的神经元还必须要迁移出神经上
46、皮。因此，通过以上4个课题的研究，可望更全面、深入地认识上皮组织形成、更新的调控机理，及其在生理、病理情况下的变化。在人员配置上，也充分考虑了合作与交叉的便利。四、年度计划年度研究内容预期目标第一年1. 建立并优化体外上皮干细胞培养系统，研究Wnt、Hpo、极性和DNA损伤通路在上皮干细胞维持或转分化中的作用；2. 筛选调节细胞不对称分裂的蛋白质，研究细胞骨架相关蛋白、有丝分裂激酶等对细胞分裂的调节及其在肿瘤样品中的表达情况；3. 筛选、分析和鉴定与纤毛结构调控或纤毛上皮细胞分化相关的衣藻突变体或基因，并进行初步的功能研究；鉴定Sufu的纤毛迁移信号域及其调控机理，筛选Shh通路纤毛转运相关的
47、小GTPase；4. 筛选不同上皮细胞肿瘤中表达异常的极性蛋白和与NudC/LIS1/Dynein信号通路相互作用的蛋白分子，研究不同炎症微环境对上皮细胞迁移和EMT的作用。1. 优化体外乳腺上皮干细胞培养系统和人类成纤维细胞转分化的培养系统，鉴定出新的Hpo相关蛋白，阐明极性信号通路在上皮细胞中功能，明确DNA损伤在小鼠iHep细胞诱导中的作用；2. 发现调节细胞不对称分裂的蛋白质，并明确几与肿瘤密切相关的细胞分裂调节因子；3. 获得与纤毛结构调控或纤毛上皮细胞分化相关的衣藻突变体或基因，并完成初步的功能研究；初步确定Sufu的纤毛迁移信号域及其Sufu磷酸化和泛素化位点，并获得相关敲入小鼠
48、，获得Shh通路纤毛迁移相关的候选小GTPase；4. 筛选出上皮细胞肿瘤的表达异常的极性蛋白，鉴定与NudC / LIS1 / Dynein通路关键分子相互作用的蛋白质分子，明确不同炎症微环境对上皮细胞EMT和细胞迁移的影响。第二年1. 深入分析Wnt、Hpo及极性信号通路在上皮干细胞维持，增殖和分化中作用；研究活性氧自由基对小鼠iHep细胞诱导的影响，并探索转分化获得人类iHep的方法；2. 对筛选出的调节细胞不对称分裂的蛋白质进行功能研究，探讨细胞骨架相关蛋白、有丝分裂激酶等调节纺锤体定向的机制及其异常对肿瘤细胞增殖影响；3. 对筛选到的重要衣藻突变体的基因进行克隆，对纤毛上皮细胞分化相关基因进行功能、亚细胞定位和互作蛋白的分析，并研究其作用机理；筛选和分析shh通路纤毛转运相关的小GTPase和IFT组分，并研究分析Sufu的纤毛转运的调控机制及其相关敲入小鼠的表型；4. 鉴定参与EMT形
