1、引 言电泳的概念：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳（electrophoresis）。电泳现象早在十九世纪初就已发现（1808年俄国物理学家Ress进行了世界上第一次电泳实验）。但电泳技术的广泛应用，则是在1937年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。原则上按电泳的原理来分，可分为二类：自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区
2、带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。 电泳的分类引 言 淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。 琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。v聚丙烯酰胺和琼
3、脂糖是目前实验室最常用的支持介质引 言引 言 另外根据支持介质形状不同，区带电泳可分为：薄层电泳、 板电泳、柱电泳。 据用途不同，可分为：分析电泳、制备电泳、定量、免疫电泳。第一节 电泳的基本原理 电泳是在电场的作用下而产生的物质运动，不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的。 . 电泳的基本原理 在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。 +-带电粒子在电
4、场中的移动与: 粒子大小有关，颗粒直径愈小愈快 粒子的电荷有关，电荷愈多愈快 粒子的形状有关，愈接近球形愈快迁移率还和下列因素有关:1.电场强度 电场强度是指每厘米的电位降 凝胶两端距离20厘米，电压降200伏特，电场强度为10伏特/厘米 电场强度越高电泳速度越快2.溶液的PH值 PH值决定带电颗粒的解离程度，决定物质所带净电荷的多少3.溶液的离子强度 缓冲液的离子强度越高，电泳速度越慢 一般在0.02-0.24.电渗现象 在电场中液体对固体支持物的相对移动 纸或纤维素带负电荷，使其接触的水溶液带正电荷，向负极移动。 应尽量避免选用有电渗作用的支持物 滤纸或醋酸纤维薄膜滤纸桥电泳缓冲液一、琼脂
5、糖凝胶电泳（水平电泳） OOOCH2OHHOOHCH2OHHOOn1.具有大量微孔 孔径大小取决于浓度： 0.075%浓度孔径800nm 0.16%浓度孔径500nm 1%浓度孔径150nm2.具有较高的机械强度 可以在1%或更低浓度下使用3.无毒，不需要催化剂4.具有热可逆性，低熔点琼脂糖回收样品容易5.生物中性，与别的生物材料结合性低6.具有高灵敏度放射自显影7.胶凝温度34-43 熔化温度75-90 低熔点琼脂糖胶凝温度低于30 (融化温度高于30 )电极缓冲液TAE: 40mM/L Tris-醋酸 1mM/L EDTA 5：24.2克Tris 5.7ml冰醋酸 10ml 0.5M/L
6、EDTATBE: 45mM/L Tris-硼酸 1mM/L EDTA 5： 54克Tris 27.5克硼酸 10ml 0.5M/L EDTA 样品缓冲液（6x）： 0.25% 溴酚蓝 0.25% 二甲苯氰FF 30% 甘油水溶液 琼脂糖凝胶分离范围 琼脂糖浓度% 线状DNA分子分离范围Kb 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2操作1. 琼脂糖加电极缓冲液水浴或微波炉融化，加 EB终浓度0.5ug/ml.2. 样品端在负极 1-5V/cm 指示剂近凝胶的另一端3. 紫外灯观察条带并拍照 聚丙烯酰胺
7、凝胶电泳(PAGE) 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acry- lamide，简称Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，简称Bis）在催化剂作用下合成的。 聚丙烯酰胺凝胶电泳按原理和操作形式的不同，主要有不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳
8、和双向电泳等类型。一、概述CH2=CHC=ONH2CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH- C=O C=O NH2 NH CH2 NH C=O-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH- C=O C=O NH NH2丙烯酰胺N,N-甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺二、聚丙烯酰胺凝胶的制备 聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种： 1.化学聚合 化学聚合的催化剂通常采用过硫酸铵（ammonium persulfate，Ap），此外还需要加速剂TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量TEMED的加入，可使过硫
9、酸铵形成自由基： S2O82- 2SO4- 这些自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚合、交联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺。. 在浓度为7.5% 的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。因此，把浓度为7.5% 凝胶称为标准胶。对于一个未知样品，常用7.5%的标准胶或4%-10% 的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。 用于研究大分子核酸的凝胶多为2.4%的大孔凝胶，此时凝胶太软，不易操作，可加入0.5%琼脂糖，或在3%凝胶中加入20%蔗糖以增加机械强度而又不影响凝胶孔径大小。 光聚合通常用核黄素为催化剂，核黄素经光照形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚
10、合反应。TEMED的存在，可以加速聚合。 上述聚合反应受许多因素的影响： （1）大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除去溶液中溶解的空气。在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。 （2）低温、低pH都会减慢聚合反应速度。 （3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可抑制聚合反应。2.光聚合不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 系统的不连续性表现在以下几个方面： 1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。 2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液
11、，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。 3.在电场中形成不连续的电位梯度。 在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。8.38.38.96.7水平板式电泳槽垂直板式电泳槽1.不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳储备液：丙烯酰胺（30%） 14.55克丙烯酰胺，0.45克甲叉丙烯酰胺，双蒸水溶解，稀释到50ml,棕色瓶储存。浓缩胶缓冲液 0.5M/L Tris-HCl, pH6.8分离胶缓冲液 1.5M/L Tris-HCl, pH8.8 凝胶配方储存液 凝
12、胶终浓度T(C=3%) 4% 7.5% 10% 15% 20%单体储液ml 0.65 3.8 5.0 7.5 10.浓缩胶缓冲液 0.10分离胶缓冲液 0.3 0.3 0.3 0.3双蒸水 4.25 10.9 9.7 7.2 4.710%过硫酸铵ul 5 15 15 15 15TEMED ul 2.5 7 7 7 7长玻璃板短玻璃板浓缩胶分离胶不同浓度分离胶分离蛋白质范围： 15% 15-45Kd 12.5% 15-60Kd 10% 18-75Kd 7.5% 30-120Kd 5% 60-210Kd电极缓冲液 0.025M/L Tris，0.2M/L甘氨酸，pH8.3样品缓冲液 0.1M/L
13、Tris-HCl pH6.8 2ml 87% 甘油 1ml 溴酚蓝 1mg 双蒸水 加到 10ml样品和缓冲液同煮沸，离心，上清加入样品孔染色和脱色考马斯亮蓝染色1.染色液： 考马思亮蓝R-250 1.0克 甲醇 450ml 冰醋酸 100ml 加H2O 到 1000ml2.脱色液： 甲醇 100ml 冰醋酸 100ml 加H2O 到 1000ml1）考马斯亮蓝染色最小检出蛋白量0.1ug2）小分子多肽用G-250效果更好银染色配液：2. 0.36%NaOH 1%柠檬酸 50%甲醇、10%醋酸 1%醋酸2. 新配制： A 0.8克硝酸银溶于4ml H2O中 B 0.36%NaOH 21ml 3
14、0%氨水 1.4ml C 将A 滴加到B中，棕色沉淀消失，加H2O到 100ml D 0.5ml 1%柠檬酸、50ul 38%甲醛，家H2O 到 100ml 操作：1.50%甲醛、10%醋酸浸泡60分钟2.H2O漂洗30分钟3.C中振荡染色15分钟4.漂洗5.D中显色（10分钟内）6.1%醋酸终止反应7.H2O浸泡60分钟1）银染色蛋白最低检出量2ng 2) 银染主要在胶表面，薄胶效果好。2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS是阴离子去污剂，带大量的负电荷 SDS和蛋白结合后，抵消了 蛋白所带电荷的差异，蛋白质只根据分子量大小泳动 SDS使亚基解聚 电极缓冲液、样品缓冲液都加SDS 凝胶配方储
15、存液 凝胶终浓度T(C=3%) 3% 5% 10% 15% 20%单体储液ml 3.4 5 10 15 20浓缩胶缓冲液 2.4分离胶缓冲液 7.5 7.5 7.5 7.510%SDS 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3双蒸水 14 17.2 12.2 7.2 2.2 10%过硫酸铵ul 10 10 10 10 10TEMED ul 10 10 10 10 10SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳测蛋白分子量分子量对数相对迁移率3.制备电泳4.转移电泳三、等点聚焦1.用两性电解质建立电场中连续线性pH梯度2.只适用于两性解离的物质电泳pH1018642pI将第一相胶条加到第二相电泳中，走向与 第一相
16、垂直等电聚焦 ( IEF )pH3.0pH10.0 第一相IEF按pI进行分离SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）电泳走向 第二相SDS-PAGE 按分子大小分离pH3.0pH10.0+四、双向电泳（two dimensional electrophoresis）：五、脉冲场电泳1.大于40Kb线性DNA用琼脂糖电泳不能分离2.脉冲场电泳可以解决A-A+B-B+A- B+A+ B-免疫电泳 把电泳技术与免疫扩散结合起来，叫做免疫电泳。 免疫电泳技术是基于抗原的电泳迁移以及与抗体的专一性免疫沉淀反应。在大部分电泳中，样品中的抗原通过含有相应抗体的pH8.6的薄层琼脂糖凝胶，抗原在pH
17、8.6时通常带强负电，而抗体在此pH不带电，不能迁移动。抗原在含有抗体的凝胶中电泳时发生免疫反应。最初，抗原过量，所以仅产生可溶性的免疫混合物，与抗原一起向阳极移动，当抗体与抗原比例合适时就形成大的、不溶性的免疫沉淀。可用于检查蛋白质制剂的纯度，研究抗血清制剂中是否具有抗某种已知抗原的抗体，检验两种抗原是否相同等。 免疫电泳： 琼脂平板电泳与双向免疫扩散相结合 抗原在琼脂电泳分离，加抗体形成沉淀线对流免疫电泳 在pH8.6琼脂电泳中，抗体带微弱负电荷，不能抵抗电渗作用，向负极移动。 抗原分子小，负电荷多，向正极移动火箭电泳 单向定量电泳 抗原在含定量抗体琼脂中电泳，二者比例合适时，产生火箭型沉淀线，火箭型的高度与抗原量成正比。交叉免疫电泳 琼脂平板电泳与火箭电泳相结合 抗原在琼脂电泳中分离，以分离的抗原以原泳动方向90度角泳向含抗体的琼脂中 根据沉淀线的位置和高度确定抗原的质与量。谢 谢
