1、书 书 书犐 犆犛 犆犆犛犅 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准犌犅犜 代替犌犅犜 蜂胶中 种酚类化合物含量的测定液相色谱串联质谱法和液相色谱法犇犲 狋 犲 狉犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 狆 犺 犲 狀 狅 犾 犻 犮犮 狅犿狆 狅 狌 狀 犱 狊犻 狀狆 狉 狅 狆 狅 犾 犻 狊犎犘犔犆 犕犛犕犛犿犲 狋 犺 狅 犱犪 狀 犱犎犘犔犆犿犲 狋 犺 狅 犱 发布 实施国 家 市 场 监 督 管 理 总 局国 家 标 准 化 管 理 委 员 会发 布书 书 书前言本文件按照 标准化工作导则第部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件代替 蜂胶中芦丁、杨梅酮、槲皮素、莰
2、菲醇、芹菜素、松属素、苛因、高良姜素含量的测定方法液相色谱串联质谱检测法和液相色谱紫外检测法 ，与 相比，除结构调整和编辑性修改外，主要技术变化如下：）增加了咖啡酸、狆香豆酸、阿魏酸、短叶松素 乙酸酯、绿原酸、阿替匹林检测项目（见第章、 、 ） ；）删除了芦丁、杨梅酮检测项目（见 年版的第章， 、 、 、 ） ；）更改了蜂胶样品提取条件（见 ， 年版的 ） 。本文件由中华全国供销合作总社提出。本文件由全国蜂产品标准化工作组（）归口。本文件起草单位：秦皇岛海关技术中心、浙江大学、厦门思健生物科技有限公司。本文件主要起草人：李学民、胡福良、崔宗岩、张翠平、李响、杨志伟、曹翠玲、刘晓茂、贾光群、张进
3、杰、曹彦忠、颜鉴翔。本文件所代替文件的历次版本发布情况为： 。犌犅犜 蜂胶中 种酚类化合物含量的测定液相色谱串联质谱法和液相色谱法范围本文件描述了蜂胶中咖啡酸、狆香豆酸、阿魏酸、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、柯因、高良姜素、短叶松素 乙酸酯、绿原酸、阿替匹林含量测定的液相色谱串联质谱法和液相色谱法。本文件适用于蜂胶中咖啡酸、狆香豆酸、阿魏酸、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、柯因、高良姜素、短叶松素 乙酸酯、绿原酸、阿替匹林含量的测定。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新
4、版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 分析实验室用水规格和试验方法术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。原理蜂胶试样用 乙醇水溶液提取，超声、离心、过滤和定容后，液相色谱串联质谱仪测定或配有紫外检测器的液相色谱仪测定，外标法定量。试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为 规定的一级水。 乙醇：无水乙醇。 甲醇：色谱纯。 甲酸：色谱纯。 乙酸：色谱纯。 乙醇水溶液（ ） ：准确移取 乙醇（ ）至 容量瓶中，用水定容。 甲醇水溶液（ ） ：准确移取 甲醇（ ）至 容量瓶中，用水定容。 甲醇 甲酸水溶液（ ） ：准确移取 甲醇（ ）以及 甲酸（ ）至 容量瓶中，用水定容。 甲酸水溶液：
5、准确移取 甲酸（ ）至 容量瓶中，用水定容。 甲酸甲醇溶液：准确移取 甲酸（ ）至 容量瓶中，用甲醇（ ）定容。 乙酸水溶液：准确移取 乙酸（ ）至 容量瓶中，用水定容。犌犅犜 标准物质：绿原酸（号： ） 、咖啡酸（号： ） 、狆香豆酸（号： ） 、阿魏酸（号： ） 、槲皮素（号： ） 、莰菲醇（号： ） 、芹菜素（号： ） 、松属素（号： ） 、短叶松素 乙酸酯（号： ） 、柯因（号： ） 、高良姜素（号： ）和阿替匹林（号： ） ，纯度均不低于 。 标准储备液：准确称取适量的标准物质（ ） ，分别用甲醇（ ）制备浓度为 的标准储备液，该储备液在 及以下温度可稳定保存个月。 标准工作溶液：移
6、取适量的标准储备液（ ） ，用甲醇 甲酸水溶液（ ）稀释成浓度为 、 、 、 、 、 的混合标准工作溶液，供液相色谱串联质谱法检测使用；移取适量的标准储备液（ ） ，用甲醇水溶液（ ）分别稀释成浓度为 、 、 、 、 、 的混合标准工作溶液，供液相色谱紫外检测法检测使用。仪器和设备 液相色谱串联质谱仪：配有电喷雾离子源。 液相色谱仪：配有紫外（或二极管阵列）检测器。 分析天平：感量 和 。 超声波清洗仪。 离心机：转速不低于 。 微量可调移液器：量程分别为 和 。 微孔滤膜： 。分析步骤 试样的制备与处理 试样的制备取混合均匀的代表性蜂胶样品约 ，密封，并做标记。在样品测定前，将被测样品放入
7、以下冰箱中保持后，取出 ，迅速用粉碎机粉碎，过孔径约为（ 目）的筛，冷藏保存于冰箱中作为待测试样。 试样的处理称取 （精确至 ）试样于 塑料离心管中，加 乙醇水溶液（ ） ，在室温超声提取 ，在 下离心 ，上清液转入 容量瓶中，按照上述步骤重复提取离心次，合并上清液，用乙醇水溶液（ ）定容至 ，混匀。取上述样品溶液用甲醇水溶液（ ）适当稀释并混匀后，取部分溶液过 微孔滤膜（ ）至样品瓶中，供液相色谱仪（ ）测定；或取上述样品溶液用甲醇 甲酸水溶液（ ）适当稀释后，过 微孔滤膜（ ）至样品瓶中，供液相色谱串联质谱仪（ ）测定。 测定 液相色谱串联质谱参考条件液相色谱串联质谱仪的液相色谱参考条件如
8、下：）色谱柱： ， ； 或相当者；犌犅犜 ）流动相： 甲酸水溶液（ ） ；）流动相： 甲酸甲醇溶液（ ） ，梯度洗脱条件参见附录的表 ；）流速： ；）柱温： ；）进样体积：。液相色谱串联质谱仪的质谱参考条件如下：）扫描方式：正负离子扫描；）检测方式：多离子反应监测（） ；）电喷雾电压： ；）雾化气体气压： ；）气帘气压： ；）离子源温度： ；）去簇电压： ；）定量离子对、定性离子对和碰撞能量：参见表。 液相色谱参考条件液相色谱仪（ ）的参考条件如下：）色谱柱： ， ； 或相当者；）流动相： 乙酸水溶液（ ） ；）流动相：甲醇（ ） ，梯度洗脱条件参见表 ；）流速： ；）柱温： ；）进样体积：；
9、）检测波长： 种酚类化合物的定量检测波长参见表。表犎犘犔犆 犕犛犕犛离子化模式、定量离子对、定性离子对、碰撞能量及犎犘犔犆 犝犞检测波长化合物离子化模式定量离子对（犿狕）定性离子对（犿狕）碰撞能量 检测波长绿原酸负离子（） 咖啡酸负离子（） 狆香豆酸负离子（） 阿魏酸负离子（） 槲皮素负离子（） 莰菲醇正离子（） 芹菜素负离子（） 松属素正离子（） 短叶松素 乙酸酯负离子（） 柯因正离子（） 高良姜素正离子（） 阿替匹林负离子（） 犌犅犜 定性与定量测定 液相色谱串联质谱法按 中液相色谱串联质谱分析条件，分别测定样品溶液和混合标准工作溶液（ ） 。如果样品溶液与标准工作溶液在相同的保留时间有峰
10、出现（保留时间偏差不超过 ） ，且在扣除背景后的样品谱图中，所选择离子全部出现，其离子的丰度与标准物质对应的离子丰度一致，相对离子丰度偏差不超过表的规定范围，可判定样品中存在被测物。以标准工作溶液浓度为横坐标，以 种酚类化合物定量离子峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线。样品溶液中 种酚类化合物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。 种酚类化合物的多反应监测（）色谱图和保留时间参见附录的图 。表定性测定中相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度 允许相对偏差 液相色谱法按 中液相色谱分析条件，分别测定样品溶液和混合标准工作溶液。如果样品溶液与混合标准工作溶液在相同的保留时间有峰出现（保留时间偏差不超过
11、） ，可判定样品中存在被测物。以标准工作溶液浓度为横坐标，以定量检测波长下 种酚类化合物峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线。样品溶液中 种酚类化合物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。 种酚类化合物标准物质的色谱图和保留时间参见图 。 平行试验同一样品应按照 和 进行平行测试。 空白试验不称取试样，其余均按照 和 进行。结果计算某一种酚类化合物在试样中的含量用色谱数据处理系统或用式（）计算：犡犮犞犿 （）式中：犡 试样中酚类化合物含量，单位为克每千克（ ） ；犮 从标准工作曲线得到的试样溶液中各目标物质量浓度，单位为微克每毫升（） ；犞 试样溶液定容体积，单位为毫升（） ；犿 最终试样溶液所代表的
12、试样质量，单位为克（） 。计算结果保留三位有效数字。定量限本文件液相色谱串联质谱法的定量限：绿原酸、咖啡酸、狆香豆酸、阿魏酸、槲皮素、莰菲醇、芹菜犌犅犜 素、松属素、短叶松素 乙酸酯、柯因、高良姜素和阿替匹林均为 ；按照 稀释倍数计算，方法对于实际样品中绿原酸、咖啡酸、狆香豆酸、阿魏酸、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、短叶松素 乙酸酯、柯因、高良姜素、阿替匹林定量限均为 。本文件液相色谱法的定量限：绿原酸、咖啡酸、狆香豆酸、阿魏酸、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、短叶松素 乙酸酯、柯因、高良姜素、阿替匹林均为 ；按照 稀释倍数计算，方法对于实际样品中绿原酸、咖啡酸、狆香豆酸、阿魏酸、槲皮素、莰
13、菲醇、芹菜素、松属素、短叶松素 乙酸酯、柯因、高良姜素、阿替匹林定量限均为 。 精密度平行试验两次测定的绝对差值不超过其算术平均值的 。犌犅犜 附录犃（资料性）液相色谱串联质谱法和液相色谱紫外检测法梯度洗脱条件液相色谱串联质谱法和液相色谱紫外检测法的梯度洗脱条件分别见表 和表 。表犃 液相色谱串联质谱法梯度洗脱条件时间 流动相： 甲酸水溶液流动相： 甲酸甲醇溶液 表犃 液相色谱法梯度洗脱条件时间 流动相： 乙酸水溶液流动相：甲醇 犌犅犜 附录犅（资料性） 种酚类化合物标准的多离子反应监测（犕犚犕）色谱图和犎犘犔犞 犝犞色谱图 种酚类化合物标准的多离子反应监测（）色谱图和 色谱图分别见图 和图
14、。犪）绿原酸定量离子对色谱图犫）绿原酸定性离子对色谱图犮）咖啡酸定量离子对色谱图犱）咖啡酸定性离子对色谱图犲）狆香豆酸定量离子对色谱图犳）狆香豆酸定性离子对色谱图犵）阿魏酸定量离子对色谱图犺）阿魏酸定性离子对色谱图图犅 种酚类化合物的多离子反应监测色谱图犌犅犜 犻）槲皮素定量离子对色谱图犼）槲皮素定性离子对色谱图犽）莰菲醇定量离子对色谱图犾）莰菲醇定性离子对色谱图犿）芹菜素定量离子对色谱图狀）芹菜素定性离子对色谱图狅）松属素定量离子对色谱图狆）松属素定性离子对色谱图狇）短叶松素 乙酸酯定量离子对色谱图狉）短叶松素 乙酸酯定性离子对色谱图图犅 种酚类化合物的多离子反应监测色谱图（续）犌犅犜 狊）柯因定量离子对色谱图狋）柯因定性离子对色谱图狌）高良姜素定量离子对色谱图狏）高良姜素定性离子对色谱图狑）阿替匹林犆定量离子对色谱图狓）阿替匹林犆定性离子对色谱图图犅 种酚类化合物的多离子反应监测色谱图（续）犌犅犜 种酚类化合物标准的 色谱图如图 。标引序号说明： 绿原酸， ； 咖啡酸， ； 狆香豆酸， ； 阿魏酸， ； 槲皮素， ； 莰菲醇， ； 芹菜素， ； 松属素， ； 短叶松素 乙酸酯， ； 柯因， ； 高良姜素， ； 阿替匹林， 。图犅 种酚类化合物的犎犘犔犆 犝犞色谱图 犌犅犜
