1、 117 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 2 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.2 Feb.2023儿童抗结核药物耐药比例法、微孔板法、全基因组测序检测对比研究张 颖 任巧丽 赵瑞秋 许红梅 龙晓茹国家儿童健康与疾病临床医学研究中心 儿童发育疾病研究教育部重点实验室 儿童感染免疫重庆市 重点实验室 重庆医科大学附属儿童医院感染科（重庆 400014）摘要：目的 探索微孔板法药物敏感性试验（DST）和全基因组测序（WGS）检测4种常用抗结核药物耐药性在儿科临床应用价值。方法 复苏培养阳性的结核分枝杆菌（MTB）保存菌株61株，分别行比例法、微孔板法和WGS检测异烟
2、肼、利福平、乙胺丁醇和链霉素的耐药性。使用一致性检验检测微孔板法和WGS与比例法的一致性。结果 61株MTB菌株经比例法检测出48株（78.7%）全敏感菌株，13株（21.3%）对至少1种药物耐药，对4种药物共同耐药的3株（4.9%）。以比例法DST为金标准，微孔板法检测异烟肼耐药的敏感度、特异度和Kappa值分别为100.0%、92.0%和0.81，利福平分别为85.7%、98.2%和0.84，乙胺丁醇分别为0.0%、100.0%和0.00，链霉素分别为80.0%、98.0%和0.81；WGS检测异烟肼耐药的敏感度、特异度和Kappa值分别为90.9%、94.0%和0.79，利福平分别为10
3、0%、98.2%和0.92，乙胺丁醇分别为60.0%、94.6%和0.50，链霉素分别为80.0%、98.0%和0.81。结论 微孔板法和WGS对异烟肼、利福平和链霉素耐药检测均有较高的敏感度与特异度，与比例法结果高度一致，均可应用于临床。而对乙胺丁醇耐药性检测的一致性较差，建议使用比例法结合WGS结果来综合评判MTB乙胺丁醇的耐药性。关键词：全基因组测序；微孔板；一致性检验；最小抑菌浓度；儿童Comparison of the ratio method drug susceptibility test,micropore-plate method and whole-genome seque
4、ncing of anti-tuberculosis drugs in children ZHANG Ying,REN Qiaoli,ZHAO Ruiqiu,XU Hongmei,LONG Xiaoru(Department of Infection,Childrens Hospital of Chongqing Medical University,National Clinical Research Center for Child Health and Disorders,Ministry of Education Key Laboratory of Child Development
5、and Disorders.Chongqing Key Laboratory of Child Infection and Immunity,The Childrens Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing,400014,China)Abstract:Objective To explore the value of drug susceptibility test(DST)by micropore-plate method and whole-genome sequencing(WGS)in detecting the drug
6、 resistance of anti-tuberculosis drugs in children.Methods Sixty-one partially preserved strains with positive culture of Mycobacterium tuberculosis(MTB)were collected.The drug resistance of isoniazid,rifampicin,ethambutol,and streptomycin were detected by proportional method,micropore-plate method
7、DST and WGS.The variants of four drug resistance related genes in WGS were summarized,and the clinical data,treatment plan and recovery of the affected children were collected.The reasons for the differences of drug resistance detected by the three methods were analyzed.Results Among 61 MTB strains,
8、78.69%(n=48)were pan-susceptible strains,1.64%(n=1)was isoniazid-resistant strain,1.64%(n=1)was streptomycin resistant strain,6.56%(n=4)were isoniazid and streptomycin resistant strains,3.28%(n=2)were isoniazid,rifampicin,and ethambutol resistant strains,3.28%(n=2)were isoniazid,rifampicin and strep
9、tomycin resistant strains,and 4.92%(n=3)were resistant to the four drugs.The sensitivity,specificity,positive predictive value,negative predictive value,and the Kappa value of micropore-plate method for predicting isoniazid resistance were 100%,92.0%,73.3%,100%and 0.81,for rifampicin were 85.7%,98.2
10、%,85.7%,98.2%and 0.84,for ethambutol were 0.0%,100%,0.0%,91.8%and 0.0,for streptomycin were 80.0%,98.0%,88.9%,96.2%and 0.81,doi:10.12372/jcp.2023.22e0083 论 著 基金项目：重庆医科大学附属儿童医院杰出青年人才基金（No.RC02017）；重庆市自然科学基金（No.CSTC2020JCYJ-MSXMX0580）；国家儿童健康与疾病临床医学中心临床医学研究项目（No.NCRCCH-2020-GP-06）通信作者：龙晓茹 电子信箱： 118 临床儿
11、科杂志 2023 年 第 41 卷第 2 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.2 Feb.2023结核病仍是危害人类健康的感染性疾病1。据估计，2020年全球有990万人患有结核病，相当于每10万人口中有127例，其中11.0%为儿童2。2009年至2015年中国大陆31个省份上报至国家疾病控制中心的肺结核中，014岁儿童平均每年发病率为十万分之2.4，西部地区发病率最高3。儿童肺结核临床表现不典型，病原学阳性率低，易延误诊治4。虽然儿童耐多药结核病（multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB）通常比成人有更好的治疗效果（儿童治愈率78.0
12、%，成人为50.0%），但不足 5.0%的儿童接受了适当的治疗 5。因此，尽早明确儿童感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的耐药谱，选择合适治疗方案，提高治疗成功率，有利于儿童结核病的防控。本研究对比比例法、微孔板法和全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）3种方法用于异烟肼（isoniazid，INH）、利福平（rifampicin，RFP）、乙胺丁醇（ethambutol，EMB）和链霉素（streptomycin，SM）4种儿童常用抗结核药物耐药性检测的检验效能。1 材料与方法1.1 材料收集选取2015年10月至
13、2020年9月在重庆医科大学附属儿童医院感染科化验室送检标本中分枝杆菌培养阳性的保存菌株87株，使用接种环接种到中性罗氏培养基上置于37 恒温培养箱中培养48周，共复苏成功61株。调取对应患儿的治疗方案与治疗结局，其中治疗结局根据世界卫生组织（WHO）2021年最新的结核病的治疗结局定义分为治疗成功组和治疗失败或死亡组6。1.2 方法1.2.1 表型药物敏感性试验 对所有成功复苏菌株分别采用比例法和微孔板法（试剂盒均购自珠海银科生物科技有限公司）行表型药物敏感性试验（drug susceptibility test，DST）及菌株鉴定。挑取罗氏固体培养基上培养的分枝杆菌菌落，移到含 0.5%吐
14、温80的生理盐水试管中，使用细菌超声分散仪（购自广东体必康生物科技有限公司）分散菌落，配成1mg/mL的菌悬液。比例法DST：根据 结核病诊断实验室检验规程7，比浊后的菌悬液，在样本稀释瓶中利用含0.5%吐温80的生理盐水，把菌悬液稀释到10-2 mg/mL和10-4 mg/mL。采用标准接种环取0.01 mL，将两种浓度菌悬液分别接种到对照培养基及含药的罗氏培养基表面。置于斜面处37 培养，松开盖子，培养2448 h后，旋紧盖子继续培养46周。当对照中性罗氏培养基的菌体生长良好后，比较含药培养基和对照培养基上的菌落数，计算耐药百分比，耐药百分比1%报告耐药，否则为敏感。含药罗氏培养基的RFP
15、浓度为 40 g/mL，INH为0.2 g/mL，EMB为2 g/mL，SM为4 g/mL7。使用含0.005 mg/mL的噻吩-2-羧酸肼（thiophene-2-carboxylic acid hydrazine，TCH）和0.5mg/mL的对硝基苯甲酸（P-nitrobenzoic acid，PNB）进行菌株鉴定，区分非结核分支杆菌和牛分枝杆菌。TCH生长为结核分枝杆菌复合群和非结核分支杆菌，TCH 未生长为牛分枝杆菌；PNB生长阳性提示非结核分枝杆菌，PNB未生长respectively.The sensitivity,specificity,positive predictive v
16、alue,negative predictive value,and the Kappa value of WGS for predicting isoniazid resistance were 90.9%,94.0%,76.9%,97.9%and 0.79,for rifampicin were 100%,98.2%,87.5%,100%and 0.92,for ethambutol were 60.0%,94.6%,50.0%,96.4%and 0.50,for streptomycin were 80.0%,98.0%,88.9%,96.2%and 0.81,respectively.
17、Conclusion Highly consistent with ratio method,micropore-plate method and WGS have higher sensitivity to predict isoniazid,rifampin,and streptomycin resistant tuberculosis in children,which can replace traditional proportional method in clinical practice.However,it is suggested to use proportional m
18、ethod combined with WGS to comprehensively evaluate the ethambutol resistance of MTB,as the consistency of micropore-plate and ratio methods is poor.Key words:whole genome sequencing;micropore-plate method;consistency test;minimum inhibitory concentration;child 119 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 2 期 J Clin P
19、ediatr Vol.41 No.2 Feb.2023提示结核分枝杆菌复合群和牛分枝杆菌。微孔板法 DST：按照产品使用操作说明书，将无菌稀释液全部加入冻干杂菌抑制剂混匀，使用移液器取 100 L加入米氏7H9液体培养基混匀后，取200 L 加入C1、D1阴性对照孔，180 L分别加入A1、B1阳性对照孔。100 L浓度为1 mg/mL的菌悬液加入液体培养基中混匀，取200 L分别加入含浓度为0.2、0.4、0.8和1.6 g/mL的含INH孔，0.25、0.5、1和2 g/mL含RFP孔，2.5、5、10和20 g/mL的含EMB孔，1、2、4和8 g/mL的含SM孔。另吸取 20 L加入A
20、1对照孔，制成1/10阳性对照孔，在A1中吸取20 L加入B1孔，为1/100阳性对照孔。置37 恒温培养箱中孵育，在1021 d根据阳性对照孔菌落直径情况进行结果判读。记录最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）值，MIC定义为与菌落生长半径小于1/10阳性对照孔的最低浓度。耐药表示MIC值大于临界浓度，敏感为MIC小于或等于临界浓度。INH的临界浓度为 0.2 g/mL，RFP为1 g/mL，EMB为5 g/mL，SM为2 g/mL7。1.2.2 全基因组测序（WGS）用接种环从分离培养好的罗氏固体培养基上刮下绿豆大小的菌体，放入含500 L
21、 TE缓冲液的离心管中，置80 水浴 30 min灭菌，干冰寄送至上海晶诺生物科技有限公司行基因组提取、质控、建库，使用Illumina平台行全基因组测序，测序结果和H37Rv标准菌株比对，行变异位点分析。1.3 统计学分析采用 SPSS 22.0 统计软件进行数据分析。非正态分布的计量资料以中位数（M）和四分位数（P25P75）表示，组间比较采用秩和检验。计数资料以例数（百分比）表示，组间比较采用2或Fisher精确概率法检验。以比例法为金标准，计算微孔板法和WGS对INH、RFP、EMB、SM耐药预测的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率及Kappa值；其中Kappa值00.2提
22、示无一致性，0.210.39为具有较低的一致性，0.400.59为一致性较弱，0.600.79为中等一致性，0.800.90为高度一致性，0.90为几乎完全一致8。以P1.6 g/mL，共计15 株（24.6%）为耐INH菌株。50株（82.0%）RFP的MIC值为0.3 g/mL，4株（6.6%）为0.5 g/mL，7 株（11.5%）2.0 g/mL为耐RFP菌株。52株（85.2%）SM的MIC值为1.0 g/mL，1株（1.6%）为 4.0 g/mL，2株（3.3%）为8.0 g/mL，6株（9.8%）8.0 g/mL，共计耐SM的菌株为9株（14.7%）。见图1B。图 1 比例法、微
23、孔板法和 WGS 鉴定 61 株结核分枝杆菌耐药结果分布A.比例法INHRFP000000060000000000111134220000011153000122233RFPRFPEMBEMBEMBSMSMSMINHINHB.微孔板法C.WGS 120 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 2 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.2 Feb.2023katG基因Ser140Asn变异位点仅分布在ING敏感的菌株，而Ser315Thr在耐药和敏感菌株中分别有9和2株，分布差异有统计学意义（P0.01）。在15株MIC值1.6g/mL的菌株中，有13株经WGS发现耐INH相
24、关基因变异，仅katG Ser315Thr在两种不同MIC值菌株间的分布差异存在统计学意义（P 0.05）。在微孔板法 MIC 值 2.0 g/mL的7株菌株中，共有分别存在rpoB基因Ser450Leu（n=4）、His445Asp（n=1）、His445Leu（n=1）和His445Tyr（n=1）4个不同的变异位点。而rpoB His445Asn存在于MIC为0.5g/mL的1株菌株中。仅Ser450Leu位点在不同MIC值的菌株中的分布差异有统计学意义（PT和inhA Ile194Thr。表1 微孔板法和WGS对四种一线抗结核药物耐药性检测的诊断价值分析药物鉴定方法 耐药性质金标准（比
25、例法）总符合率/%灵敏度/%特异度/%阳性预测值/%阴性预测值/%Kappa值耐药/株 敏感/株INH微孔板法耐药11493.410092.073.3100.00.81敏感046WGS耐药10393.490.994.076.997.90.79敏感147RFP微孔板法耐药6196.785.798.285.798.20.84敏感153WGS耐药7198.410098.287.51000.92敏感053EMB微孔板法耐药0091.80.01000.091.80.00敏感556WGS耐药3391.860.094.650.096.40.50敏感253SM微孔板法耐药8195.180.098.088.99
26、6.20.81敏感250WGS耐药8195.180.098.088.996.20.81敏感250表2 INH耐药相关基因变异位点在比例法和微孔板法中鉴定为不同耐药性菌株分布基因变异位点比例法MIC/gmL-1INH耐药(n=11)INH敏感(n=50)P1)1.6(n=15)0.2(n=46)P1)katGSer140Asn0(0.0)1(2.0)1.0001(6.7)0(0.0)0.246Ser315Thr9(81.8)2(4.0)0.00111(73.3)0(0.0)T1(9.1)0(0.0)0.1801(6.7)0(0.0)0.246inhAIle194Thr1(9.1)0(0.0)0.
27、1801(6.7)0(0.0)0.246注：1)Fisher 精确概率法n(%)121 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 2 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.2 Feb.2023Met306Val位点，而在敏感菌株中有3株分别包括Ala356Val、Gly406Ser和Met306Val位点，各位点的分布差异均无统计学意义（P0.05）。微孔板法中，2株MIC值为5.0 g/mL的菌株均存在Met306Val位点，不同 MIC 值菌株之间差异有统计学意义（Pc位点（n=1）；而在51株SM敏感菌株中，仅有1株存在rpsL基因Lys43Arg变异位点，该位点在两组
28、中的分布差异有统计学意义（Pc（n=1）的耐药相关变异位点。在1株MIC为4.0g/mL的菌株中存在rpsL Lys88Arg变异。rpsL基因Lys43Arg和Lys88Arg变异位点在不同MIC值菌株中的分布差异有统计学意义（P0.05）。见表6。3 讨论目前，MTB耐药性检测仍以比例法和BACTEC分枝杆菌生长指示管960系统为金标准。而比例法DST检测时间长达48周，BECTEC仪器设备造价较高，且表型DST由于生物安全问题，均不适用于结核病发病率较低的发展中地区使用。微孔板法DST为改良的液体培养法，其操作便捷，观察结果时间较短，并可明确药物的MIC值，已逐渐应用于临床。随着分子生物
29、学技术的发展，二代测序技术逐渐成熟且价格明显降低，WGS可用于MTB的菌种鉴定、耐药预测、异质性耐药及菌群传播的研究8，已渐从科研走向临床应用。而本研究为WGS和微孔板法的儿童感染的MTB耐药性检测的临床应用提供了基础数据。表4 EMB耐药相关基因变异位点在比例法和微孔板法中鉴定为不同耐药性菌株分布基因变异位点比例法MIC/gmL-1EMB耐药(n=5)EMB敏感(n=56)P1)5.0(n=2)2.5(n=59)P1)embBAla356Val0(0.0)1(1.8)1.0000(0.0)1(1.7)1.000Gln497Arg1(20.0)0(0.0)0.0820(0.0)1(1.7)1.
30、000Gly406Ser0(0.0)1(1.8)1.0000(0.0)1(1.7)1.000Met306Ile1(20.0)0(0.0)0.0820(0.0)1(1.7)1.000Met306Val1(20.0)1(1.8)0.3782(100.0)0(0.0)0.001注：1)Fisher精确概率法表5 SM耐药相关基因变异位点在比例法和微孔板法中鉴定为不同耐药性菌株分布基因变异位点比例法MIC/gmL-1SM耐药(n=10)SM敏感(n=51)P1)8.0(n=8)4.0(n=1)1.0(n=52)P1)rpsLLys43Arg6(60.0)1(2.0)0.0017(87.5)0(0.0)
31、0(0.0)c1(10.0)0(0.0)0.1641(12.5)0(0.0)0(0.0)0.148注：1)Fisher精确概率法表3 RFP耐药相关基因变异位点在比例法和微孔板法中鉴定为不同耐药性菌株分布基因变异位点比例法MIC/gmL-1RFP耐药(n=7)RFP敏感(n=54)P1)2.0(n=7)0.5(n=4)0.3(n=50)P1)rpoBSer450Leu4(57.1)0(0.0)0.0014(57.1)0(0.0)0(0.0)0.001His445Asn1(14.3)0(0.0)0.1150(0.0)1(25.0)0(0.0)0.066His445Asp1(14.3)0(0.0)
32、0.1151(14.3)0(0.0)0(0.0)0.180His445Leu0(0.0)1(1.9)1.0001(14.3)0(0.0)0(0.0)0.180His445Tyr1(14.3)0(0.0)0.1151(14.3)0(0.0)0(0.0)0.180注：1)Fisher精确概率法n(%)n(%)n(%)122 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 2 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.2 Feb.2023本研究以比例法 DST 为金标准，WGS 检验对INH和RFP耐药性诊断的敏感度和特异度处于90.9%100%，与既往研究结果相近9。在一项总结了20项研究
33、的综述中，WGS对RFP耐药性检验的敏感度与特异度分别为98.0%（95%CI：93.0%98.0%）和98.0%（95%CI：98.0%100.0%），而INH分别为97.0%（95%CI：94.0%99.0%）和93.0%（95%CI：91.0%96.0%）9。在近期同类研究中，与表型DST相比，WGS检测RFP、INH、EMB和SM耐药的敏感度与特异度分别为96.7%和98.6%、75.5%和97.1%、93.1%和93.7%、68.6%和99.6%10。除了EMB外，其余3种药物的检测结果与本研究均较为接近，提示WGS对检测INH、RFP和SM的耐药性与比例法DST具有高度的 一致性。
34、本研究的微孔板法检验结果，除EMB外，INH、RFP和SM的敏感度与特异度处于80.0%100.0%，与比例法DST具有高度的一致性，与同类研究中RFP敏感度和特异度分别为97.1%、100.0%的结果较一致11。类似研究中的INH、RFP和SM的敏感度、特异度和Kappa值分别为93.9%、98.8%和0.94，93.8%、99.6%和0.95，88.7%、100%和0.9312，与本研究结果相近。因此，微孔板法检测RFP、INH和SM的耐药性均与比例法具有高度一致性。为探索3种检测耐药方法存在差异的原因，本研究分析了4种药物耐药相关基因变异位点在2种表型DST鉴定为敏感和耐药的菌株中的分布
35、差异。MDR-TB的出现是在INH耐药的基础上增加了RFP耐药，因此更应关注MTB的INH耐药相关变异13。本研究中，比例法DST鉴定为INH敏感的菌株而在微孔板法或WGS中鉴定为耐药的菌株分别有4株和3株，分别存在katG基因Ser315Thr和Ser140Asn变异位点。既往已证实katG基因Ser315Thr变异位点与INH高水平耐药相关14。在本研究中，包含该变异位点菌株INH的MIC值均1.6 g/mL，再次证实该位点与INH耐药相关。而含Ser140Asn变异位点的菌株MIC值为1.6 g/mL，且本研究中变异率较低，在比例法中鉴定为INH敏感菌株。而在相关研究中发现106株耐IN
36、H的菌株中仅有1株存在katG Ser140Asn和Ala139Pro共同变异10。因此，该位点是否与耐药有关仍需更多研究验证。虽然与其他抗结核药物相比，RFP耐药相关基因变异不易出现，但由于RFP广泛用于抗结核治疗，耐药率正逐年上升15。超过95.0%的RFP耐药相关变异集中在编码RNA聚合酶的亚单位的rpoB基因上16。多数存在于81bp的426452位（大肠杆菌编码507533位）氨基酸的RFP耐药决定区域（rifampicin resistance determining region，RRDR），其中90.0%位于435、445和450位点，且均为RFP高水平耐药相关的基因变异位点1
37、7。本研究中耐RFP菌株的rpoB基因变异位点集中在445（50.0%）和450（50.0%）位点上，均处于RRDR，多数菌株的MIC值大于2.0 g/mL，进一步证实该位点与高水平RFP耐药相关。相关研究使用基因芯片技术检测MDR-TB时，发现耐RFP变异位点集中在445（16.7%）和 450（63.3%）位点上，且替换氨基酸与本研究一 n(%)表6 结核病患儿61例不同治疗结局的菌株耐药属性分布鉴定方法耐药属性治疗成功组(n=55)治疗失败或死亡组(n=6)2值P比例法INH耐药10(18.2)1(16.7)0.001.000RFP耐药6(10.9)1(16.7)0.001.000EMB
38、耐药4(7.3)1(16.7)0.000.990SM耐药10(18.2)0(0.0)0.5771)微孔板法INH耐药14(25.5)1(16.7)0.001.000RFP耐药5(9.1)2(33.3)1.200.274SM耐药9(16.4)0(0.0)0.5791)WGSINH耐药12(21.8)1(16.7)0.001.000RFP耐药6(10.9)2(33.3)0.830.364EMB耐药5(9.1)1(16.7)0.001.000SM耐药9(16.4)0(0.0)0.5791)注：1)Fisher精确概率法 123 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 2 期 J Clin Ped
39、iatr Vol.41 No.2 Feb.2023致16。因此，考虑在本研究中3种方法存在差异原因可能与本研究使用的为复苏菌株，表型DST可能表现不稳定有关。随着新型抗结核药物的出现，SM已较少用于儿童结核病的治疗。在既往研究中，存在rpsL基因Lys43Arg突变位点的MTB菌株SM的MIC值均大于32 g/mL，考虑该位点与SM耐药相关18。而本研究中，比例法鉴定为SM敏感而WGS鉴定为耐药的1株MTB菌株中仅存在该耐药位点，考虑可能与表型DST表现不稳定有关。本研究中，WGS 和微孔板法检测 EMB 耐药性的结果与比例法DST一致性较差，考虑与表型DST中EMB的错误率较高有关。表型DS
40、T是MTB耐药性检测的金标准，该观点会混淆耐药基因突变位点的识别，尤其是EMB，据报道表型DST中EMB耐药性检测的错误率较高19。而本研究中，微孔板法中未鉴定出EMB耐药菌株，可能本研究使用耗材的EMB的MIC值低于WHO的界定值。约50.0%70.0%的EMB耐药的MTB分离株存在embB基因306497位密码子的基因变异20。已证实306、406和497位密码子变异可导致低水平和中等水平的EMB耐药21。在泰国的一项筛查EMB耐药的MTB临床分离株embB变异分布的研究中发现，306位密码子存在氨基酸错义变异的概率为50.6%，其中含有Met306Val变异的菌株占44.1%22。本研究
41、中，在3株经比例法DST鉴定为EMB敏感而WGS耐药的菌株中分别含有Met306Val、Gly406Ser和Ala356Val变异位点。仅Ala356Val的功能不详，在EMB耐药菌株中的报道罕见，功能仍待验证。本研究中菌株对应的61例患儿治疗结局与3种方法鉴定的耐药和敏感菌株分布的相关性分析发现，差异均无统计学意义，提示治疗结局与患儿感染的MTB对4种药物是否耐药无关。有研究发现与MDR-TB不良治疗结局相关的独立风险因素包括高水平莫西沙星耐药、环丝氨酸耐药、导致高水平氟喹诺酮耐药性的变异和ethA变异，与EMB耐药及相关基因变异无关23。但本研究结果也可能存在偏倚，与样本量偏少，耐药菌株比
42、例偏小有关。综上所述，本次研究仍存在样本量偏小，DST使用菌株为复苏菌株而非临床分离株等不足。本研究证实微孔板法和WGS检测INH、RFP和SM耐药的效果与比例法DST高度一致，可应用于临床。而EMB的耐药性检测可结合比例法DST和WGS结果综合判断。参考文献：1 刘珍敏,赵瑞秋,许红梅.结核感染 T 细胞斑点试验、涂片检查和结核菌素试验在儿童结核病诊断中的价值J.临床儿科杂志,2019,37(4):282-287.2 World Health Organization.Global tuberculosis report 2021 M.Geneva:World Health Organiza
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