1、计算机学报2009年12期，2009，32（12） DNA计算机原理、进展及难点()：DNA分子的固定技术许进1)，李菲1), 2)1) (北京大学信息科学技术学院高可信软件技术教育部重点实验室，北京，100871)2) (空军装备研究院，北京，100085)摘 要 在DNA计算机的研制中，DNA分子的固定是首先需要处理的一个最为基本的技术问题。事实上，DNA分子的固定技术不仅是生物计算的一个基本技术，而且是整个基因工程、生物芯片、甚至某些疾病诊疗的基础。基于此，本文将对DNA分子的固定技术给予较为系统地研讨，包括基本原理、具体方法等。文中引入了“DNA分子固定系统”的结构体系，并对该结构体系
2、中载体子系统、固定剂子系统、标记子系统这三个主要子系统进行了详细地论述。关键词 DNA计算机；DNA固定技术；固定系统；固定剂、载体、分子标记、磁珠分离技术；AcrditeTM技术DNA Computer Principle, Advances and Difficulties(V):Immobilization Technology of DNA MoleculeXu Jin1), Li Fei1)2)1) (Institute of Software, School of Electronics Engineering and Computer Science, Peking Univer
3、sity, Key laboratory of High Confidence Software Technologies (Peking University)，Ministry of Education, Beijing, 100871)2) (Equipment Academy of Air Force , Beijing 100085)Abstract: In the research of DNA computer, immobilization of DNA molecule is an essential technology at first. Actually, immobi
4、lization of DNA molecule is not only a basic tool of biological computation, but also the foundation of the whole Genetic Engineering and bio-chip, even some disease treatment. In this paper, immobilization technology of DNA molecule, including its basic principle and factual methods is discussed in
5、 detail. The architecture of bio-molecular immobilization system is presented, and we mainly introduce its three subsystemssubstrate system, fixer system and molecular marker system. Key words: DNA computation; immobilization of DNA molecular; immobilization system; fixer; substrate; molecular marke
6、r; magnetic bead purification; AcryditeTM technology; 1. 引言从目前的研究现状来看，DNA计算研究中主要存在三个难点，第一个是解空间指数爆炸问题，即随着问题规模的增大所需要的DNA量呈指数增长；第二个难点是编码问题。对于规模较大的DNA计算而言，作为代表问题“数据”的DNA分子的编码涉及到诸如解链温度的一致性、特异性杂交的准确性、与DNA计算中各种生化操作的适应性等各种不同约束条件的限制。因而，DNA序列的编码问题是一个很困难的数学问题。许多学者认为这个问题是NP-完全问题123；第三个难点是解的检测问题。检测问题几乎“充满”了DNA计算
7、的始终。其中如何给出快速准确的检测技术，以及如何利用现有的IT技术进行解的检测是DNA计算机研究中的重点4。从目前的研究现状来看，DNA传感器技术可能是DNA计算机检测中一个很有希望的工具。而DNA分子的固定技术则是DNA传感器中的一项关键技术。另外，DNA分子的固定技术在医疗、生物芯片以及基因工程等众多领域均为基础性的技术。作为DNA计算中的“数据”DNA分子，若在计算过程中只在溶液中进行杂交反应，而不受其它载体的约束，则我们把这种DNA分子称为无载体的DNA分子。若DNA分子被固定在某物体上，则把该物体称为DNA分子的载体。在DNA计算中，通常这些载体有诸如磁珠、凝胶、金属、玻璃等。而如何
8、将DNA分子固定在这些载体上，即DNA分子的固定问题，不仅是DNA计算中的一个基本问题，也是研制DNA计算机必须解决的问题。本文拟重点对DNA分子的固定技术展开研讨。实际上，DNA分子的固定技术不仅是研制DNA计算机的基本技术，而且是DNA计算模型研究中的常用技术5。如1994年Adleman所建立的求解有向Hamilton路问题的DNA计算模型中就使用了将DNA分子固定在磁珠上的技术6，该研究组在2002年的DNA计算模型中使用了将DNA分子固定在聚丙烯酰胺凝胶上的固定技术7。文献8中所建立的枚举型图顶点着色DNA计算模型中也使用了磁珠固定DNA分子的技术等。文献9所建立的DNA计算模型中，
9、固定DNA分子在玻璃上。追其历史，生物分子固定技术的研究始于上世纪60年代，美国学者Clark首先采用了固定化酶方法制作酶电极10，其后，关于这方面的研究发展迅速1112。目前DNA探针的固定方法主要有共价键合法、原位合成法、吸附法、自组装膜法、生物素-亲和素方法、AcryditeTM技术等。这里还要提及的是，我国在DNA固定技术及应用方面的研究也取得了可喜的成果，如姚守拙院士13，张先恩教授14等人的工作。另外，刘盛辉等15将石墨电极表面硅烷化导入氨基，然后用碳二亚胺 ( EDC )作偶联活化剂，在电极表面固定单链 DNA。郑赛晶等16采用微孔穴充石蜡石墨电极固载ssDNA。黄海珍等 17
10、对 DNA探针的固定方法作了详细评述。有关这方面一些详细的介绍参见文献18。2. DNA分子的固定系统本节引入了“DNA分子固定系统”的结构体系，以便于更能系统地刻画DNA分子的固定技术。所谓“DNA分子固定系统”，是由载体子系统、对象子系统、固定剂子系统和标记子系统四个子系统构成。可将其定性地描述为：如图2.1所示：图2.1 固定系统结构示意图根据DNA计算模型的不同，可能用到的DNA载体也会不同。载体也称为支持物，是指作为固定相的材料19。常用的载体有诸如磁珠、凝胶、玻璃、量子点以及金箔等，如图2.2所示：图2.2 载体子系统在DNA计算中，固定的对象主要是DNA分子。当然，在RNA计算中
11、的固定对象主要是RNA分子，而在整个基因工程中的固定对象则是蛋白质、RNA与DNA为主体的生物大分子等，如图2.3所示：图2.3 生物计算中的对象子系统所谓固定剂，是指将固定对象固定在特定载体上所需要的介质，多数采用的是偶联，如共价键的偶联，离子键、氢键、磁力等各种引力的吸附，另外还可采用生物素-亲和素技术、分子自组装膜等，如图2.4所示：图2.4 固定剂子系统固定DNA分子或者其它生物大分子的主要目的是用于检测。因此，被固定的DNA分子常常需要进行标记。标记DNA分子通常采用诸如荧光标记、放射性和非放射性核素标记等方法，如图2.5所示：图2.5 标记子系统从下节开始，我们将围绕着固定系统中相
12、应的子系统进行详细讨论。3. 载体子系统及其在DNA计算中的应用本节将主要介绍DNA计算中常用的三种载体：基于试管型DNA计算中常用的磁珠；基于凝胶电泳技术的载体Acrydite；关于表面计算中的玻璃或者金箔等作为载体的处理。3.1 磁珠技术在DNA计算中，经常需要将双链DNA序列中的一条固定起来，通过加热，让互补的另一条参与杂交反应。若在试管里进行杂交反应，则通常将一条DNA链固定在磁珠上。我们把将一条DNA链固定在磁珠上的技术称为磁珠固定分离技术，简称为磁珠技术。这里将主要介绍磁珠技术的机理，特别针对其在DNA计算中应用的原理给予详细介绍。一般磁珠固定分离技术的基本方法是：通过抗原对偶联在
13、磁珠表面的抗体或亲和配体的特异性识别，在外加磁场的作用下，达到分离、检测、纯化样品的目的20。磁珠分离方法主要有两类：一类是所谓的免疫-磁珠分离(Immuno-magnetic beads, IMB)，其方法是在磁珠表面包被特异性单克隆体，主要用于分离细菌和病毒2122；另一类是所谓的探针-磁珠分离(Probes-magnetic beads，PMB)，具体操作是在磁珠表面包被亲和素，通过亲和素与生物素之间的特异性反应，将探针标记在磁珠表面。这种方法主要应用于捕捉核酸和PCR扩增2324，以及用于捕捉扩增产物，进行特异性分析25等。采用磁珠作为DNA分子载体有三大优势26：亲水性磁性粒子能够比
14、较稳定地悬浮在水溶液中，并可在外加磁场作用下定位于某一部位，其表面可固定各种功能分子如酶、抗体、DNA，甚至细胞等，因此在分子生物学、免疫测定、细胞分离与分类、基础医学、临床诊断、临床治疗等方面具有良好的应用前景；作为DNA分子的固定化载体，磁珠有利于固定化DNA分子从反应体系中分离和回收，还可以利用外部磁场控制磁性材料固定DNA分子的运动和方向； 磁珠作为DNA分子的固定载体还具有以下优点：固定的DNA分子可重复使用，降低成本；适合大规模连续化操作；将DNA分子固定在磁性粒子表面后，DNA分子的化学活性不受到任何影响。由于在DNA计算中主要采用PMB(探针-磁珠分离)方法，故在本文中只详细介
15、绍这种方法。下面，我们将从磁珠的结构、材料与原理以及操作使用方法等几个方面来给予介绍。(1). 磁珠结构磁珠由载体微球和配基结合而成，一般直径为。理想的磁珠为均匀的球形，具有超顺磁性及保护性壳，其结构如图3.1所示，其中磁性材料主要有：- Fe2O4、Me-Fe2O4（Me = Co，Mn，Ni）、Fe3O4、Ni、Co、Fe、Fe-Co和Ni-Fe合金等， 图3.1 磁珠的基本结构图示目前被研究最多且应用最广泛的是铁及其氧化物（Fe、和等）27。高分子材料主要有：聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、多糖(纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖等)和牛血清白蛋白等。磁珠表面常带有化学功能的基团，如-OH、-NH2、
16、-COOH和-CONO2等，使得磁珠载体几乎可以偶联任何具有生物活性的蛋白2829；功能配基主要有：配基必须具有生物专一性的特点，而且载体微球与配基结合后不影响或改变配基原有的生物学特性，保证微球的特殊识别功能。还可以在功能配基上配有亲和素。在单链DNA分子5-端加入与亲和素相配的生物素3031。(2). 磁珠固定分离技术在DNA计算中应用原理及具体使用方法磁珠技术是DNA计算中经常用到的一种分离技术，分离用的磁珠表面需要大量的羟基、羧基、羰基、氨基，通过洗液与DNA结合，在磁场的作用下从溶液中分离出DNA，再用一种洗液使DNA从磁珠表面分离出来，最后通过磁场把废的磁珠分离出来，得到纯的DNA
17、溶液。通常用亲和素-生物素方法进行磁珠固定分离。 图3.2 磁珠在DNA计算中的应用原理示意图磁珠技术在DNA计算中的应用的基本原理是：利用生物素-亲和素法将计算问题中的探针DNA分子固定到磁珠上，探针DNA分子与待测溶液中的靶分子进行杂交反应后，再用磁力架将带有双链DNA的磁珠分离出来，其示意图如图3.2所示。具体操作步骤如下32：第一步、在磁性粒子表面共价结合链霉亲和素，使得磁性粒子能够吸附连有生物素的核苷酸探针，达到快速、有效分离靶分子的目的；第二步、取库链 DNA 于试管中, 加入生物素修饰的靶分子，进行反应，然后加入磁珠中，反应后弃去上清；第三步：用SSC洗磁珠, 弃去上清。再加入S
18、SC后用磁力架快速分离, 将上清转移至新的试管中；第四步：根据计算需要，可以多次重复第三步，由此可以得到分离出来的靶DNA分子。3.2 凝胶载体上一节我们给出了作为载体磁珠的结构与性质，并讨论了磁珠在DNA计算中的作用。在这一小节里，将给出在DNA计算中，另外的主要载体-凝胶的结构与性质。凝胶主要应用于电泳之中，而电泳分离技术则是DNA计算中的一个最为基本的环节。聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。 (1) . 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺（Polyacrylamide）简称PAM，由丙烯酰胺单体聚合而成，是一种
19、水溶性线型高分子物质33。聚丙烯酰胺凝胶的作用原理如下3435：a) 絮凝作用原理：PAM用于絮凝时，与被絮凝物种类表面性质，特别是动电位，粘度、浊度及悬浮液的PH值有关。颗粒表面的动电位，是颗粒阻聚的原因，加入表面电荷相反的PAM，能速动电位降低而凝聚。 b) 吸附架桥：PAM分子链固定在不同的颗粒表面上，各颗粒之间形成聚合物的桥，使颗粒形成聚集体而沉降。 c) 表面吸附：PAM分子上的极性基团颗粒的各种吸附。 d) 增强作用：PAM分子链与分散相通过种种机械、物理、化学等作用，将分散相牵连在一起，形成网状，从而起增强作用。丙烯酰胺称单体，甲叉双丙烯酰胺称交联剂，在水溶液中，单体和交联剂通过
20、自由基引发的聚合反应形成凝胶。在聚丙烯酰胺凝胶形成的反应过程中，需要有催化剂参加，催化剂包括引发剂和另速剂两部分36。引发剂在凝胶形成中提供始自由基，通过自由基的传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应，加速剂则可加快引发剂放自由基的速度。常用的引发剂和加速剂的配伍如下表：表3.1 聚合反应催化剂配伍引发剂加速剂（NH）SOTEMED（NH）SODMAPN核黄素TEMED其中 (NH4)2S2O8是过硫酸胺；TEMED是N，N，N，N四甲基乙二胺；DMAPN是-二甲基胺基丙晴； 用过硫酸铵引发的反应称化学聚合反应；用核黄素引发，需要强光照射反应液，称光聚合反应。聚丙烯酰胺聚合反应可受下列因素影
21、响37：a) 大气中氧能淬灭自由基，使聚合反应终止，所以在聚合过程中要使反应液与空气隔绝； b) 某些材料如有机玻璃，能抑制聚合反应； c) 某些化学药物可以减慢反应速度，如赤血盐；d) 温度高聚合快，温度低聚合慢。 以上几点在制备凝胶时必须加以注意。凝胶的筛孔，机械强度及透明度等很大程度上由凝胶的浓度和交联决定。每100亳升凝胶溶液中含有单体和交联剂的总克数称凝胶浓度，常用T%表达；凝胶溶液中交联剂占单体和交联体总量的百分数称为交联度，常用C%表示.聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续的和不连续的两类，前者指整个电泳系统中所用缓冲 液，pH值和凝胶网孔都是相同的，后者是指在电泳系统中采用了两种或两种
22、以上的缓冲液，pH值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力。单体丙烯酰胺的分子为：；交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺的分子结构为。乙烯基一个接一个的聚合作用从而形成丙烯酰胺链的交联，构成了如下三维空间凝胶网络图，如图3.3所示：图3.3 聚丙烯酰胺凝胶结构(2) . AcryditeTM技术为了较详细地讨论AcryditeTM技术，以及下面叙述方便，我们在此先给出聚合DNA分子的基本单元-核苷酸的分子结构，如图3.4所示：图3.4 核苷酸结构 其中为核苷酸所携带的碱基，为鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶其中一种。Acrydite是一种可连接寡核苷酸作为5端修饰的基于丙
23、烯酸亚磷酰胺的化学物质，Acrydite的分子式是C19H36N3O3P。分子量为385.48。经Acrydite修饰的寡核苷酸能与硫醇修饰的表面发生共价反应或能够合并进入聚丙烯酰胺凝胶。它也可以使高分子通过丙烯酸共价结合到表面支持物，经Acrydite修饰的高分子可以通过丙烯酸单体聚合，还能与巯基或硅烷表面反应3839。这一技术由Kenney40于1998年首次提出，目前较大规模的DNA计算，20个变量的3SAT问题也是由此固定技术实现的41。该方法在DNA计算中的原理是：利用常规的DNA合成技术，将酰胺分子引入到寡聚核苷酸的5 端，结合有酰胺分子的寡聚核苷酸探针可以和酰胺溶液混合，从而形成
24、含有探针的凝胶层，而凝胶分离时则使用标准的方法42。这种技术应用于DNA计算中，可以使一些问题得到很好的改善。Acrydite修饰的DNA分子与聚丙烯酰胺凝胶相连如图3.5所示：图3.5 Acrydite修饰DNA与聚丙烯酰胺联结采用Acrydite技术固定DNA分子时，其优点有如下几个方面：a) Acrydite修饰物的连接比耦合更加稳定。在多种不同温度及PH值的水溶液条件下，Acrydite修饰的核苷酸都比较稳定；b) Acrydite修饰物可以在固相表面形成共价键。Acrydite修饰物与固相表面连接可以形成高稳定性的C-C键或硫醚键，在标准的分子生物学规则中，这些键在通常情况下是十分稳
25、定的；c) 结合效率高。Acrydite连接DNA分子的效率通常高达90%以上；d) 用途广泛。Acrydite修饰的DNA分子可以固定在玻璃、凝胶聚合物或层析介质上：i. 用于微阵列的玻璃显微镜幻灯片。巯基和丙烯酰胺的连接具有稳定的化学性质，可以使Acrydite修饰的DNA分子固定在玻璃显微镜幻灯片上从而形成微阵列；ii. 当Acrydite修饰物与另一种单体如丙烯酰胺共聚合时，产物为一附着DNA的交联凝胶，DNA在聚合物中的浓度决定于加入DNA的浓度和Acrydite修饰物相对于聚合物单体的比率。此类交联凝胶可以应用于电泳捕获阵列；iii. 当Acrydite修饰物与固定表面覆盖着丙烯基
26、的另一种单体相聚合时（如塑料表面覆盖丙烯硅烷），Acrydite修饰物会与此单体在固定表面形成一层凝胶层，Acrydite的浓度和凝胶层的性能可以在一定范围内有所调整，使得表面具有特殊功能，如疏水性；iv. 当Acrydite修饰物与另一种单体如丙烯酰胺共聚合（不使用交联剂）时，产物是带有DNA分子的线性聚合体，线性聚合体具有广泛应用，例如，线性聚合体和一些丙烯酰胺衍生物形成的物质在室温下是可溶解的，但是在高于45时会凝结和沉淀，这种由室温决定溶解度的性质可以广泛应用于多种分离过程。在图3.6中，我们利用AcryditeTM技术与巯基表面、凝胶和玻璃相连的原理图43。 图3.6 1、Acryd
27、ite修饰物与巯基反应，形成稳定的硫醚键；2、Acrydite修饰物与其它丙烯酸根共聚合（如聚丙烯酰胺）3、Acrydite与玻璃表面相连Acrydite将DNA与凝胶交联的操作通常采用目前分子生物实验室广泛使用的标准凝胶聚合技术44，过程中不需要高活性的化学交联剂。Acrydite连接DNA可以达到表面密度为200fmol可杂交的探针/mm2。这个密度相比利用其他连接方法要有利的多。通过升高凝胶温度或在缓冲溶液中加入变性剂，还可以测试单核苷酸的多态性，这种方法同样适用于测试PCR样品扩增中的变异。另外，Acrydite凝胶技术还可以广泛应用于其它研究领域，例如基因表达分析和核酸从样品中的提取
28、纯化。3.3 玻片或其他载体在DNA计算研究中，表面计算中固定DNA分子的支持物最多的是玻璃和金片，其中玻片是研究和应用最多的DNA分子固定支持物，因为它具有如下几个优点4546：a) 价格低廉，且所固定的DNA样品可以共价结合在预处理后的玻片表面上；b) 玻片是一种刚硬的介质，耐高温，可以经受高离子强度溶液的清洗；c) 玻片是一种非孔性材料，杂交体积可以减至最小，从而加快了探针与目标DNA之间杂交和退火的过程；d) 玻片荧片信号本底低，背影干扰小；e) 可使用双荧光甚至多荧光检测系统，在一个反应中同时对两个以上的样品进行并行处理。由于玻片是平面结构，上样量小，使得检测的灵敏度低，因此可以对玻
29、片的表面进行改性，通过各种化学反应在表面引入各种官能团（氨基、醛基、羧基、环氧基、巯基等），使DNA与玻片表面的官能团共价结合，从而稳定地固定于玻片表面。在DNA计算中，通常采用的玻片预处理方法有如下两种：(1). 氨基硅烷化预处理先将玻片硅羟基化，再用3-氨丙基三乙氧基硅烷化，这样可以使得玻片表面带上氨基的官能团，此官能团可以与多种偶联剂作用，来固定末端修饰的DNA分子。利用戊二醛分子作为偶联剂时，戊二醛分子两端的醛基可以与玻片上的氨基及DNA连接起来47，该反应条件温和，操作简便，可在440及pH6.08.0条件下进行。若利用二异硫氰酸酯作为偶联剂时，2个异硫氰酸酯基分别与玻片上的氨基和N
30、H2(CH2)6修饰的DNA的氨基发生偶联反应，从而将DNA分子固定。可能残存未反应的异硫氰酸酯需要进行封闭，减少非特异性吸附，连接后的结构如图3.7所示48： 图3.7 通过二异硫氰酸酯将DNA固定在玻片上在水溶性碳二亚胺EDC的存在下，末端带有羧基的DNA分子可以通过酰胺键与玻片上的氨基偶联，连接过程如图3.8所示49：图3.8 A 氨基修饰的DNA与富马酸酐反应， 转化为羧基修饰的DNA； B 与带有苯环氨基的玻片连接；C 与带有丙基氨基的玻片连接酰胺键可以在温和的条件下定量形成，并且生成稳定的产物，其中两个步骤-在玻片上引入氨基和在氨基修饰的DNA上引入羧基都很容易实现，预处理完后的偶
31、联反应过程一步完成，不需要引入手臂分子，也不需要中间分离和提纯，是一种方便、有效的固定DNA分子的方法50。(2). 环氧乙烷基预处理在玻片表面还经常引入化学活性很强的环氧乙烷基团，它与羟基、氨基和巯基之间都可产生较为稳定的化学键，所以可以用于固定末端带有羟基、氨基和巯基修饰的DNA分子。在玻片表面引入末端环氧基团最常用的方法是用3-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(COPS ) 和硅羟基化的玻片进行硅烷化反应，使玻片表面产生末端环氧乙烷基团，可以与带有羟基、氨基、巯基的DNA分子偶联，如图3.9是带有巯基的DNA分子通过环氧基团固定在硅羟基化的玻片上51。图3.9 带有环氧乙烷基团的玻片与巯基修饰
32、的DNA分子偶联还有一种方法在玻片表面引入末端环氧基团52：先将玻片引入羟基或氨基等基团，再与二环氧乙烷化合物反应。二环氧乙烷化合物通常都含有一长链亲水手臂分子，在其末端带有反应活性的环氧乙烷基，环氧乙烷基和玻片表面的氨基或羟基之间反应结合成较稳定的化学键，而另一端保留了可以和带有羟基、氨基、巯基的 DNA分子反应的环氧乙烷基团。这种方法可以使玻片表面与固定的DNA之间带上不同长度的长链手臂分子。但是反应过程中的高交联和损伤会使环氧乙烷活性基团减少，进而减少了DNA的固定化密度。所以偶联时高浓度的羟基、氨基、巯基修饰的DNA参与反应，才能保证DNA的固定化效率。(3) . DNA分子在金片上的
33、固定金片是指通过真空蒸发到硅片或玻片表面的一层金膜，金膜可以与巯基产生强烈的作 用，通过 AuS键将DNA固定。比较成熟的在金片上固定DNA分子的方法是将DNA的3端或5端用HS（CH2）6修饰，然后在Au表面自组装53，如图3.10所示：图3.10 金表面的自组装膜此种方法通过调节巯基修饰的DNA在金片表面的自组装时间可以控制DNA的固定化密度，并且在适当的固定密度下，探针对于目标DNA分子有着很高的杂交效率。在固定DNA以后，还需要用烷基硫醇对金片表面进行封闭以减少非特异性吸附，因为金片表面对DNA能够产生非特异性吸附。在自组装过程中，还可以加入聚赖氨酸间接固定DNA分子，能够起到两个作用
34、：可以封闭金表面，减少DNA分子的非特异性吸附；在利用SPR测定DNA杂交时，可以增加金表面有机物分子的质量。4 固定剂子系统将DNA分子固定在某载体上，类似将一张“画”挂在一个“墙壁”上。DNA分子相当于“画”，而“墙壁”则相当于载体。就好像画不可能直接挂在墙壁上一样，DNA分子也不可能直接与相应的载体结合。根据墙壁的不同，挂画的方式也不同，可能用钉子的方法，也可能用胶水或浆糊等粘贴的方法等。对于将DNA分子固定在一个载体上也有类似的方法。根据载体的不同而确定不同的方法。目前DNA计算中所采用的载体主要磁珠、凝胶，玻璃或金属表面等。一般而言DNA分子的固定技术主要有如下6种类型，这六种类型相
35、当于“钉子，或者胶水与浆糊”等的功能。它们分别是：共价固定法、生物素-亲和素反应系统、吸附法、原位合成法、有序自组装技术和LB膜技术。下面将分别给予简要介绍。4.1 共价固定方法共价结合法，也称为共价固定法，是通过双官能试剂的功能团或偶联活化剂，使生物活性分子与不容性载体表面上的反应基团发生化学反应形成共价键（如酰胺键、酯键、醚键等）的一种固定化方法，是应用最多的固定方法之一。这种固定方法的优势是结合牢固、得到的修饰层稳定，DNA分子以一端固定，结构灵活，易进行分子杂交，载体不易被生物降解以及使用寿命长等；该固定技术的不足是操作步骤较多，若利用酶活化载体时，酶活性易被降解，且制备具有高活性的固
36、定化酶比较困难。共价结合一般分为两步进行54：:(1) 首先活化载体，引入活性键合基团，将不容性载体表面进行修饰，使其带上各种固定所需要的活性基团，如羟基、氨基等，以便和探针DNA结合；(2) 通过双官能试剂或偶联活化剂使载体与探针DNA结合。常用活化试剂有氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、环氧丙基三甲基硅烷(GOPS)等。常用双功能试剂有戊二醛(GA)、对硝基苯氯甲酸酯(NPC)、二溴乙烯等。共价键合法的载体有无机载体和有机载体两种，一般主要采用有机载体，很少用无机载体55。 共价键合法是固定探针比较理想的方法，在制备DNA 电化学生物传感器中得到广泛应用。通常是通过共价键将探针固定到电极上
37、，根据不同的电极表面，可以采用不同的共价键合方法。对于金电极，主要是利用金与硫形成金2硫键，还可以利用巯基标记的探针将其固定到金电极。这里要强调的是：缓冲溶液、固定温度、固定时间、链的长短等因素对探针的有效固定均有影响。4.2 生物素-亲和素固定法生物素-亲和素系统 (biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。由于它具有生物素与亲和素之间的高度亲和力及多级放大效应，并与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合，使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高；生物素分子又易于活化，与核酸分子偶联率高而不影响核酸分子的
38、生物活性，所以BAS已经广泛应用于生物医学实验研究的各个领域，既可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测研究中，亦可制成亲和介质用于各类反应体系中反应物的分离、纯化。另外BAS也在生物传感器研究中也起到了重要的作用56，主要是关于BAS的固定化问题以及应用BAS固定生物物质的问题的研究。BAS的固定化有多种形式：亲和素可以直接地不可逆吸附到 Au、Ag等电极表面上形成亲和素单分子层；生物素也可以吸附在电极表面形成生物素分子的固定层，从而来固定BAS体系。生物素(biotin)是动、植物体内广泛分布的一种小分子生长因子，又名辅酶R或维生素H。生物素的分子式为：，其分子量：244.31。生物素又
39、叫维生素H。生物素分子有两个环状结构，其中 I 环为咪唑酮环，是与亲和素结合的主要部位； II 环为噻吩环， C2 上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的唯一结构，经化学修饰后，生物素可成为带有多种活性基团的衍生物活化生物素25。自然界中至少存在有两种生物素，一种是-生物素(存在于蛋黄中)，另一种是-生物素(存在于肝脏中)。它们的基本化学结构相同，都是噻吩环与尿素相结合而成的环化合物。不同的是，-生物素带有异戊酸侧链，-生物素有戊酸侧链，其结构如图4.1所示57。生物素难溶于水，易溶于二甲基甲酰胺(DMF)。-生物素 -生物素图4.1 两个类型的生物素分子结构生物素固定连接DN
40、A时，需要将DNA分子氨基化，然后才能与生物素分子结合，连接后的分子（生物素-DNA分子）如图4.2所示：图4.2 生物素连接DNA分子)kB9| Uf(亲和素亦称抗生物素蛋白、卵白素或亲和素，是从卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白。等电点(pI)为10-10.5，含糖约l0，分子量为 68kDa。纯品为白色粉末，易溶于水，在pH9-13的溶液中性质保持稳定，耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用，80加热2min，仍保持活性，特别是和生物素结合后十分稳定。但对强光和Fe2+比较敏感。亲和素由4个相同的亚基组成，能结合4个分子的生物素。亲和素与生物素之间的亲和力极强，比抗原与抗体的亲和力至少高1万倍，因此
41、二者能快速结合，而且反应不受外界干扰，具有高度特异性和稳定性58。 *g p4o1zq;n m:S0亲和素主要包括卵白亲和素、链亲和素、卵黄亲和素及类亲和素等。后两种因其特异性亲和力低，研究不多，前两种目前已深入研究并得到广泛应用。 亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。在固定DNA探针时，一般是将亲和素共价偶联或通过静电作用吸附到支持物上，随后将生物素连接的DNA通过生物素与
42、亲和素之间的专一性亲和作用而固定。用共价偶联的方法固定亲和素比直接吸附亲和素有更好的稳定性及重现性。以Au电极为例，可以将电极氨基化和羧基化，再连接亲和素，利用亲和作用固定连有生物素的DNA分子，固定过程如图4.3所示：图4.3 亲和法固定DNA分子 基于生物素-亲和素反应系统固定DNA分子的方法凭借简便、温和、高效的特点，在DNA固定技术领域中越来越受到重视。4.3 吸附法所谓吸附法是通过非共价键作用将探针DNA分子直接或恒电位吸附到载体（多为电极）表面，或由探针DNA片段中的磷酸根负离子与载体表面带正电荷的修饰层通过静电作用而固定。吸附法主要分为物理吸附、化学吸附和恒电位吸附三种，其中物理
43、吸附包括静电吸附、范德华力吸附；化学吸附包括氢键吸附、离子键吸附。（1）物理吸附。Pang 59 等将ssDNA 或dsDNA溶液直接滴至新抛光的玻碳电极表面，涂匀，在空气中自然晾干，无菌二次水冲洗，充分浸泡，即得到几乎为单分子层的DNA修饰电极。此外，还可以利用这一原理将单链DNA固定在石墨电极、金电极及汞电极表面，制成DNA修饰电极。（2）恒电位吸附。Wang60等利用恒电位富集方法将DNA探针修饰到碳糊电极上，他们先将电极在+1.7V下活化1 min，然后将电极浸入含有DNA 的电解质溶液中在+0.5V富集2 min即可固定探针DNA分子。此种固定方法简单、快捷，但探针DNA分子的再生较
44、为困难。（3）化学吸附。分别利用带正电荷的聚吡咯、阳离子聚合物壳聚糖将单链DNA固定在电极上，可以大大提高探针DNA的固定效率6162。吸附法固定DNA，操作步骤简单，固定化速度快，但是在高盐浓度的溶液中很容易解脱，因此不宜在高盐浓度的条件下使用63。吸附法固定DNA大多数是通过DNA片段与支持物上的多个作用点完成的，甚至DNA片段可能平躺于支持物表面，因而DNA固定化密度可能较小。由于多个作用点固定DNA使DNA片段的运动自由度减小，这极大地影响了DNA与互补DNA的杂交效率。在电化学传感器中，可以对洁净的电极进行活化,在电极表面产生一层亲水性界面, 通过此界面将探针吸附固定于其上64 。还
45、有将生物素吸附到电极上，通过生物素亲和素的亲和作用将探针固定到电极表面。然而，这种装置不能严格清洗，因为它不是共价键合, 在杂交过程中可能脱附, 而且DNA 结构会发生扭曲, 使固定的DNA 无法进行杂交, 导致杂交效率很低。因此吸附法没有成为DNA 电化学传感器制备的主要方法。4.4 原位合成法1989年Koch65等发明了一种新的DNA分析技术称原位DNA合成技术（Primed in situ labeling），简称PRINS。其基本原理是变性的染色体与未标记的DNA探针发生原位特异性配对，然后以该DNA探针作引物，再利用DNA聚合酶大片断将引物原位延伸， 同时在反应混合液中加入标记的脱
46、氧核糖核苷三磷酸，这样就可以对新合成的DNA进行同步标记， 可以直接检测出引物原位延伸的位置。这一技术步骤简便、快速，且不需克隆DNA作探针， 因而成为DNA固定技术中的重要手段。这项技术的优点具体有以下几方面66：（1） 可以使用高浓度的探针以缩短反应时间；（2） 使用大量的探针时不会导致背景污染，因为未杂交的探针没有被标记；（3） 信号的强度不受引物大小的影响，寡核苷酸引物和较长的克隆探针一样可以检测出染色体上的微小变异；（4） 孵育时间短，可以较好地保存染色体和其他细胞结构。光化学引导下的原位DNA合成技术是在载体上原位合成DNA探针序列。合成时将传统的以亚磷酰胺为基础的DNA合成技术加
47、以修饰，亚磷酰胺5末端改为光不稳定的保护基团，在透光位点紫外光照射下，发生光化学作用可以除去保护基团，通过合成连接子贴附于载体上，再用A、T、C、G4种核苷液冲洗，发生化学偶合形成DNA探针。此种方法已用于DNA芯片研究67。4.5 自组装技术（self-assembly SA) 分子自组装是生命系统中最本质的内容之一。大量复杂的、具有生物学功能的超分子系统(蛋白质、核酸、生物膜、脂质体等)正是通过分子自组装形成的68。此外，分子自组装也是分子合成中的重要手段之一，是构成具有某种功能的材料(液晶、多层膜、单层膜、功能性表面等)的有力工具。由于这些材料具有新奇的光、电、催化等功能和特性，在分子器件、分子调控等方面有潜在的应用价值，因而分子自组装体系的设计与研究引起了研究者极大的兴趣，近年来受到了广泛的重视6970。有序自组装法就是基于分子的自组（分子间化学键）作用，在固体表面自然形成高度有序的单分子层的方法。分子自组装的本质是分子与分子在一定条件下依赖非共价键分子间作用力(氢键、范德华力、静电力、疏水作用力、堆积作用、阳离子
