1、一20 n碳酸氢钠 2.0 g/L n青、链霉素 各100卑位毫升 42 培养基的配制 RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位毫升 加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。 调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10） 43 细胞传代方法 n 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 n 1悬浮生长细胞传代 n 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养 液后再混匀传代。 n 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l 2一23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 n 2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） n 此类细胞部分呈现贴壁
2、生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹 n打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 n 3贴壁生长细胞传代 n 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。 44 贴壁生长细胞传代方法： n1 吸光培养瓶中的培养液 n2 加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准 ） n静置2-10 min（显微镜下动态监测）。 n3 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。 n4 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。 n5 吸取1/101/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。 n6 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。 n7 将后者放入培养箱中培养。 45 细胞计数 n
3、血细胞计数器：手工计数细胞 nCoulter计数仪：人工计数 46 47 培养细胞活力测定 n细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段 之一。 n任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成， 从形态上区别死、活细胞是困难的。 n1 细胞克隆形成率实验 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞 群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成卒用来表示细胞 的增殖能力 n 克隆形成率比克隆形成数接种细胞数 n缺点：操作繁琐 n优点：精确、可靠 48 2台盼蓝法 n 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占 n细胞中的百分比表示细胞恬力 n n已淘汰 49 3 四唑盐（MTT）比色法 n四唑盐（M
4、TT）商品名为噻唑蓝， n 四吐盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不 溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞 没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色 结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪 测定OD值 n MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试 n验、肿瘤放射敏感性实验等。 50 n操作步骤 n （1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培 养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37、5 nCO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间） n （2）加
5、入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；继续培养3 小时。 n （3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升孔），将 培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。 n （4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果 ，绘制 51 n操作步骤 n （1）单细胞悬液接种于96孔培 养板；103-104细胞/孔，每孔培养 基总量200微升（96孔培养板每孔 容积370微升），37、5 nCO2培养箱中培养一段时间（根据 实验目的决定培养时间） n （2）加入2毫克毫升的MTT 液（50微升孔）；继续培养3小 时。 n （3）吸出孔内培养液后，加入 DMSO液（150微升孔），
6、将培 养板置于微孔板扳荡器上振荡10分 钟，使结晶物溶解。 n （4）酶标仪检测各孔OD值（检 测波长为570 nm）。记录结果，绘 制细胞生长曲线 52 细胞冻存和复苏 n细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作 。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减 少入力、经费，减少污染，减少细胞生 物学特性变化。 53 冻存和复苏的原则：慢冻快融 n当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱 水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰 晶。 n n 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致 产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞 膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是 防止小冰晶形成大冰
7、晶，即冰晶的重结晶。 54 慢冻程序 n标准程序： n 当温度在-25 以上时， 12 /min n 当温度达-25 以下时， 510 /min n 当温度达-100时，可迅速放入液氮中 n 细胞冻存器 n简易程序： n 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳 ，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12 的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液 氮中。 55 低温保护剂的应用 n在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提 高冻存效果。 n常用的低温保护剂是DMSO，它是一种 渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高 胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻 结过程，能使
8、细胞内水分在冻结前透出 细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰 晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。 56 细胞冻存方法 n1预先配制冻存液： 含20%血清培养基 n 10% DMSO n2 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适 量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml) n3 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻 细胞名称和冷冻日期。 n4 年后，存洁率可达80一叽。DMSO液用 培养液配好， n避免因临时配制产热而伤害细胞。对人造血干 细胞的研究证57 细胞复苏方法 n （l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37 38 水浴中，使其融化（1分钟左右）。 n （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍 以上。 n （3）低速离心10分钟。 n （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的 细胞。 58 犚蠐骭犚骭骭!犚骭!犚謐骭谀骭!犚1犚骭!犚骭骽!犚餀骽犚骽犚骽犚骽犚骽!犚骽犚骽爡犚髍犚言髍犚犚谀髍犚髍犚犚蠐髝犚髝犚訐髝犚謀髝!犚髝刡!犚犚髭髭谐髭!犚髭!犚C鄐鄐舀舐脀鄐鄀瀐鄀鄀鄀脐瀀瀀w匊胂蜃鶓倜鶁髭!犚犚犚髽犚髽犚髽犚髽髽犚髽!犚戡骎!軹犚訐骎骎谐骎骎躾犚骎躏犚軯犚骞!黙犚鄁脀瀀栀一伀倀儀刀匀吀唀嘀圀堀夀娀嬀尀崀帀开怀愀戀挀搀攀昀最栀椀樀欀氀洀渀漀瀀焀爀猀琀甀瘀眀砀礀稀笀簀紀縀缀耀脀舀茀萀蔀蘀蜀蠀褀言謀谀贀輀退鄀踀鈀錀鐀销阀需頀餀騀鬀鰀鸀鼀鴀
