1、过糖基化：重组蛋白的过糖基化不仅影响均一性，而且有时还会影响 表达量。尝试胞内表达、敲除N-糖基化位点可以降低重组蛋白的糖基 化水平，也可以在纯化时加入酶切除过长的糖链以提高蛋白均一性。 菌株老化：表达菌株多次传代后表达量会明显降低，有时表达第一 次、第二次产量都很高，然后突然下降。长期表达时应注意保持菌株 的新鲜：用原始菌株多做一些甘油菌，-80冻存，每次表达之前都取 出一管重新划线。 重组蛋白不分泌或分泌量低：在分泌之前，重组蛋白必须正确折叠并 形成正确的二硫键，错误和不当折叠都会干扰分泌通路。共表达辅助 因子，如分子伴侣（Hsp70、90家族）、二硫键异构酶Pdi，过表达未 折叠蛋白相应
2、转录因子Hac1p（诱导分子伴侣和分泌通路酶的表达） 等方法可以帮助重组蛋白进入分泌通路，提高分泌表达量和蛋白活 性。 33 3. 昆虫细胞表达系统 昆虫细胞表达体统适宜表达高等真核生物蛋白。昆 虫细胞在培养中可以达到较高的细胞密度，具有复 杂的翻译后修饰，如蛋白质的正确折叠与切割、二 硫键形成、糖基化、磷酸化、酰化、酰胺化、羧甲 基化等，很多修饰过程与哺乳动物都是相同的。与 酵母相同，昆虫细胞也可以进行胞内和分泌表达， 启动子很强，重组蛋白表达量高，而且更适宜表达 多元蛋白复合物。 昆虫细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒 载体的感染。利用质粒转染可以获得稳定的转染细 胞，但实验周期较长
3、，需几周甚至几个月时间，适 宜连续发酵培养；利用病毒表达系统则可快速感染 细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，适 用于目的蛋白的表达检测。 34 3.1 昆虫细胞表达系统 目前常用的昆虫细胞表达系统有杆状病毒- 昆虫系统、InsectSelect稳定表达系统和果蝇 表达系统三种。 35 3.1.1 杆状病毒-昆虫（Baculovirus Expression Vector System, BEVS）表达系统： 杆状病毒（baculovirus）是一类以昆虫细胞为天然宿主的核型 多角体病毒，其基因组为80-160kb大小的单一闭合双链超螺旋 DNA，约编码154个基因。目前研究较多的是苜蓿
4、银纹夜蛾核多 角体病毒 (AcNPV)。AcNPV基因组具有较大的柔韧性，可以容忍 较大片断的外源基因和多个外源基因的插入，病毒感染后期， 宿主细胞会被裂解，因此BEVS不适于连续培养。 AcNPV能够感染大约30种鳞翅类昆虫细胞，在一定条件下也可 以感染果蝇细胞，其中草地贪夜蛾 (Spodoptera frugiperda， Sf) 卵巢细胞和粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）胚胎细胞被发展成最常 用的表达宿主。杆状病毒常用的表达宿主有来源于草地贪夜蛾 的Sf9、Sf21和来源于粉纹夜蛾的High-Five、Tn-368，这些细胞 质生长较快，能够达到较高的细胞密度，适应悬浮培养，可
5、以 使用无血清培养基，是重组蛋白表达的理想宿主。由于昆虫细 胞的N-糖基化与哺乳动物细胞有较大差异，人们设计了能够持 续表达多种糖基转移酶的Mimic Sf9细胞，用以表达更高等生物 的蛋白。 36 AcNPV的基因表达分为立早期表达、早期表达、晚期表达、极晚期表 达4个阶段。前两个阶段的基因表达早于DNA复制，而后两个阶段的 基因表达则伴随着一系列的病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过 程中，有两种高效表达的蛋白：多角体蛋白和P10蛋白。多角体蛋白 是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达3050 ，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保 持稳定和感染能力；P
6、10蛋白也是病毒复制非必需成分，可在细胞中 形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因和P10基因的启 动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载 体系统理想的外源基因插入位点。如将外源基因取代多角体蛋白基因 构成重组病毒，病毒体内不含有包含体。不形成包含体的病毒和形成 包含体的病毒在平板中形成的空斑不同,利用这一特征筛选含有外源 基因的重组病毒。 使用BEVS系统需要将外源基因整合入杆状病毒基因组中。解决这个问 题主要有两种思路：Bac-to-Bac系统改造了AcNPV基因组，将之构建成 为一个超大的穿梭质粒（130k），使其能够在大肠杆菌中复制（单拷 贝），再将带有外
7、源基因的供体质粒转入带有病毒质粒的大肠杆菌中 ，使它们在原核宿主体内完成重组过程，将表达盒插入多角蛋白启动 子下游，纯化后感染昆虫细胞收集重组病毒；In-Fusion系统将野生型 杆状病毒线性化，与带有外源基因和同源重组序列的载体直接共转染 宿主细胞，只有正确重组的病毒才能进行自我复制并裂解宿主，以此 来制备重组病毒。不论使用哪种方法，都需要在收集到大量重组病毒 后再感染新鲜宿主，以获得高质量的重组蛋白。 37 3.1.2 稳定表达系统 InsectSelect系统和果蝇表达系统都是使用整合型质粒载体的重组蛋白表达系统。 整合型载体可以实现重组蛋白的连续发酵，外源基因随机整合入染色体，表达受
8、插入位点的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长特性，因此需要做大量的筛 选工作才能获得稳定的表达菌株。 InsectSelect（IS）系统： IS系统可以进行重组蛋白的昆虫细胞连续分泌培养。此系统使用的载体为pMIB/V5- His A，B，C质粒，包括OpIE2、OpIE1启动子、蜜蜂蜂毒分泌信号肽（HBM）、灭 瘟素抗性基因、C端V5抗原和His标签，以及在大肠杆菌中复制所必须的组分。 OpIE2、OpIE1启动子来源于杆状病毒OpMNPV，该病毒的天然宿主为冷杉合毒蛾 Orgyia pseudotsugata，常用的表达宿主有Sf9、Sf21、High Five、Kc1（果蝇）、S2
9、（果蝇）。OpIE2启动子比OpIE1强5-10倍，用于外源基因的表达，后者则用于灭 瘟素抗性基因的表达。OpIE2为组成型强启动子，与HBM信号肽协同，使得重组蛋 白能够在昆虫细胞中进行连续分泌培养。质粒C端有可选的V5抗原和His标签，方 便重组蛋白检测和纯化。 外源基因插入载体后在大肠杆菌中扩增，纯化后转染宿主细胞。一旦宿主细胞成 功表达重组蛋白，即可利用灭瘟素抗性进行筛选，获得高拷贝的细胞株进行连续 发酵。 IS系统使用的质粒很小（3.6K），易于操作，表达流程相对简单，可以进行连续发 酵，有些重组蛋白在IS中的表达量比BEVS还高，是一种比较实用的昆虫表达系 统。 38 表3：昆虫表
10、达载体pMIB/V5-His B质粒图谱 39 果蝇表达系统（Drosophila Expression System，DES)： 果蝇表达系统使用S2果蝇细胞为表达宿主，可以进行重组蛋白 的胞内、分泌表达，可以连续表达。在培养瓶中，S2松散半贴 壁单层生长，同时也可以很好的适应摇瓶和发酵罐的悬浮培养 ，可以使用无血清培养基。外源基因在S2细胞系一般能够达到 500-1000个拷贝。DES有多种表达载体，包括组成型/诱导表 輀!蠐腠鄐灐恰恠瀰恠怰偠恐腠怀偠偰恰灠恐恀脀怀偀瀀酐鄀鄀腐恀縀鎂茏肥鼀騀!刡谀鴀!鸐鬀餀!馯!脡高!髩!验!髬!骝挱鄡!111騀!鯩!鯪!鮌!鯟!鼀言!賬!鲍蔡!1!褐騐!
11、輀、氃偠偀怠怠鄠杀瀆悑t偀灰灰恠艠鄀鄠鄀恀偠偀恠倀偐酐倀腀瀀倐偀鄠倀偐偐偐偐鄐瀐瀀偐鄐鄀脐昀怀爊艈嗹蠀!趨1!麹!黩!麻!謐鰀贀追1辎!辞!辏迏!迟!迯!迿!龘1!鄀灰脀鄀灰瀐倀灠酰偐!焄螙懕舟鰀齱襠鎂巏!艁焄悟螉巏腝7艁焃抟艋脧六年级班主任工作个人总结 【导语】工作总结是对工作的检查与分析，也会为了以后工作不在出现相同的问题，避免错误的发生。六年级班主任工作个人总结是我为大家准备的，希望对大家有帮助。篇一：作为班主任，每天面对的，是几十双渴求知识的眼睛，每天接触的，是几十颗等待滋润的心灵。如何让这一双双的眼睛充满智慧之光怎样使这一颗颗心灵健康成长这不仅需要班主任具有强烈的事业心，责任感，更需
12、要班主任具备一定的组织管理能力。下面结合自己的工作实际，谈一谈做班主任工作的一些体会。一、思想教育工作常抓不屑学生已经进入了六年，思想已经成熟，做任何事都有自己的主张，所以要耐心细致地做好他们的思想工作。本学期我主要从以下几方面进行教育。1、发挥自身表率作用。小学生对班主任有着一种特殊的信任和依赖情感。班主任的自身素质，道德修养，班主任的一言一行，一举一动，无形之中会成为全班几十个孩子的榜样。因此，我在工作中爱岗敬业，严守职业道德，以爱润其心，以言导其行，用爱心去滋润学生，用语言去感化学生，教给学生做人的道理，增强学生前进的动力。其身正，不令而行。其身不正，虽令不从。在班级工作中要求学生做到的
13、，我往往率先垂范。每次在学校的劳动中，我总是与学生们一起干活。带动了学生们劳动的积极性，保质保量完成学校交给的每一项任务。2、建立一个良好的，科学规范的班级制度，即班规。对学生的管理，如果仅靠师生间的个人感情，则易造成管理上的放纵及随意。因此，开学之初我就制定一个科学规范切实可行的班规。而且充分发挥学生干部的作用。利用班规对学生进行考核，每月一总结，对于优胜者进行奖励。这大大激发了学生学习的热情，同时也制约了思想差的学生的一些行为，使他们屏弃自身的不良习惯。3、及时开好班会课。班会课是对学生进行思想教育的一条行之有效的途径，所以我及时抓好每周二的班会课时间，对学生进行教育。在上班会课之前，我都
14、认真分析班级当前的现状，结合班级的实际确定班会主题，并且认真备课，以求取得的教育效果。本学期做到了定期召开班会，班会的内容形式多样，学习规范守则;向学生灌输五讲五做的内容，对学生进行安全教育，法制教育;带领学生学习雷锋，了解革命先辈的事迹等等。一系列的内容使学生受到了不同方面的教育，也取得了很好的教育效果。4、不辞劳苦做好学生的家访工作。促使学生健康成长，只靠教师的工作是不够的，还应该得到家长的协助。因此，每学期的班级工作中我都有目的，有计划地走访学生家长，使家庭教育与学校教育密切配合。本学期由于少数学生不听话，我便充分利用家长的力量来协助自己的工作，每次家访时我都向家长介绍本班的学习情况，孩
15、子的学习，纪律等各方面的情况，争取家长的意见，以取得家长对班级工作的支持和协助。这样教师和家长密切联系，共同教育学生，有效地促进了学生的全面发展。忙的时候我便利用打电话，开家长会的形式与家长取得沟通，由于我的不断教育，使学生在行为上受到一定的约束，有的学生对我说：老师这学期你怎么这么严哪我笑着说：严就是对你们的爱，其实我的心理有很大的压力，自己的学生自己怎么能不了解呢他们太淘气，如果我这个班主任稍一放松，那不知会是什么后果，我害怕他们同以往的毕业生一样，所以自己宁愿把在校的所有时间都用在他们身上，自己的工作回家去做。只希望自己用爱心去感化每一个学生。二、耐心细致做好后进生的转化工作有人曾说过，
16、一个班级的后进生占班级总数的百分之几或更多为百分之十几，如果放弃了对后进生的教育，对集体而言，集体的希望才失去了百分之几，而对于一个家庭而言，每一个后进生是家庭希望的，如果这个家庭失掉了这个希望，就等于家庭的希望地破灭了。这样的说法很有道理，这样就给我们教育工作者提出了一个严峻的挑战，为了挽救一个后进生，为了找回一个家庭的希望;为了挽救一个集体，找回众多家庭的希望，我们怎么办知难而进!决不放弃任何一个学生，决不放弃任何一个集体，是每个教育者的信念，也是我的信念。若要变后进为先进必先寻找到一条行之有效的途径。三年的班主任经验告诉我：在教育影响后进生的过程中，师生之间往往会产生心理上的碰撞，对小学
17、生来说，身心都在成长，应该先取学生的接受点去教育学生，以情*，以情励人，施之以爱，拉其进步，贵在扶持，长抓不懈。人无完人，我也同样如此，在班主任工作中自己还存在许多的不足，生气的时候，我也会大声训斥他们;虽然做班主任工作以来我没有做过惊天动地的伟业，但我走过的每一段路，留下的每一个足迹，都能折射出我生命的价值。我是失去了很多，但我无怨无悔。篇二：班主任是班级工作的直接管理者，直接责任人，是做好班级管理的关键核心，是学校未成年人思想道德建设的主力军，是学生个性发展的榜样和领路人。要做好班主任工作，确实不易。作为班主任首先要热爱这一工作，把这一岗位当作一项崇高的事业来做，具有无私奉献精神，因为班主
18、任工作意味着更多的奉献，更多的付出，物质方面的回报非常少。但却会赢得更多的家长和学生的尊重，会给你的人生留下许许多多，让你难以忘怀的回忆，更会增强你战胜自我，战胜困难，向往美好生活的信心和勇气。根据这一学期的班主任经历，作一简要的总结，概括。一、培养建立一支有责任心的班干部，工作实行精细化责任制。班主任工作非常辛苦，事务繁忙。怎样才能把班主任工作做好，又能抽出更多的时间，研究备课，研究课堂，有更多的时间辅导学困生本人经过多年的实践，认为，作为班主任一定要充分相信学生，许多工作放手让学生去做，这样既培养锻炼了学生的能力，又使自己从繁杂的班级事务中解放出来。这需要班主任培养小干部，对班级管理做好指
19、导。如班长的统领和协调检查;卫生委员的值日安排，检查;学习委员每天的早读，课外作业的收交;体育委员的广播操，眼保健操检查;文艺委员的活动安排检查;小组长的带头作用等。把班级的诸项事务，与学生协商，实行自愿承包，责任到人。并由责任人自己制定出检查标准，班委会通过执行。二、培养学生的兴趣，发展学生的特长，为班级争荣誉。1、除了正常的教学和其他一些班级事务外，重要的工作就是组织，指导开展各种活动。如何开展好活动，如何在各种活动中立于不败之地，我注意有意识地引导培养各方面的人才。平时多多注意学生的特长爱好，多多注意各方面的培训信息，与家长沟通好，做好家长，学生的思想工作，让他们积极的参加培训。有了这些
20、小人才，无论是出黑板报，举行文艺演出，还是召开运动会，都让我省心不少，并取得了不错的成绩。2、注重学生的示范带头作用的发挥。让有特长的学生，带动起其他对各方面有兴趣的同学，组织开展一些小型的班级活动，学生在一起交流，在一起切磋。达到相互借鉴，相互学习，相互提高的目的。三、早到校，勤沟通。作为班主任，很多情况下需要早到校。新学期开学我早到校;收费早到校;考试早到校;活动早到校;周一升旗早到校;邀请家长早到校。做好班主任工作离不开家长的支持，离不开课任教师的帮助支持。需要与他们勤沟通，取得他们的信任支持和帮助。学生的家访工作非常重要，与家长沟通好，班级的各项活动，各项工作就会得到家长的支持，出现问
21、题也容易解决。家访的形式多种多样，直接家访我提前与家长联系，做好家访的准备，多谈学生好的表现，提出希望，增强家长的信心，让家长和学生知道，老师是多么重视他，对他充满了很高的期望。面对面交谈效果非常好，但由于学生多，居住也比较分散，全体学生都家访，需要占大量时间。我一般采取电话沟通，方便及时。家访工作我坚决做到：困难学生(学习，生活)必访，问题学生必访，出现波动的学生必访，有特长的学生必访，新转来的学生必访，家庭出现裂痕的学生必访，学生生病必访等。这样可以融洽与家长的关系，使自己的工作得心应手。总而言之，在这一学期的班主任工作中，我努力使自己做得轻松自在，但又决不放松对班集体的管理，自绐至终我都
22、在追求一种奋发向上的班集体氛围，不求，但求更好。整个班集体在我的悉心指导下正向着更高更美的目标前进。!颊飺!颋!颛!颫!颻!飋!飛!飫!飻!颌踀G【怤偐酀,l爊瑩蜆樀鷎!颛!賍!趺!鷊!鴐蠀戡贀鬐頀飈!飘飨褐餀飙言颪!颺!飊!飚謀鬀谀飬!远蠰【&嘠吀(p艁爃祩苍脯楲鎇楲憌鎂鄐!軚鄡1爇豩蝡茳怀軚鄡2爊赩舨觵郰夀!龛!髌刡騀餀偰1眀销挀栀琀洀氀/w前台访问/c-00004-9-220076-0-0-0-0-9-0-1.html220.181.108.10401礀销挀栀琀洀氀5Qmwap前台访问/d-466220.html117.95.182.1670赠1笀销挀栀琀洀氀5Smwap前台访问/p-2962969.html116.179.32.3301攀搀栀琀洀氀
