1、药物中有机溶剂残留量的测定 1 残留溶剂（Residual Solvent） 定义：药物中的残留溶剂系指在原料药或辅 料的生产过程中，以及在制剂制备过程中使 用或产生的，但在工艺过程中未能完全去除 的有机溶剂。（Organic Volatile Impurities） 研究的性质：杂质研究的范畴 2 国内外主要相关指导原则和文件 ICH Q3c 杂质：残留溶剂的指导原则 FDA：Guidence for Industry:Q3c Impurities:Residual Solvents EMEA:Position Paper on Specification fro Class 1 and C
2、lass 2 Residual Solvents in Active Substances 化学药物有机溶剂残留量研究技术指导原则 3 国内研究现状：越来越重视，但仍存在很多 不规范之处 原因 ：时间短、经验少、对本质认识不够， 对国际新研究结果跟踪不及时，对已有指导 原则内涵领会不深刻 本讲目标：通过分析和总结，明确一些问题 ，使研究更科学、更规范。 4 各国药典中残留溶剂测定收载情况 USP35版 Chemical Tests / Residual Solvents 185 EP7.0版 2.4.24. Identification and control of residual solv
3、ents ChP2010年版附录 P 残留溶剂测定法 以上药典方法是残留溶剂研究的重要参考依据 5 ICH 指导原则 人用药品注册技术要求国际协调会议 ( International Conference of Harmonizition ICH ) ICH 将药品生产及纯化过程中常用的69 种有 机溶剂按照对人体和环境的危害程度分为4 类。 6 残留溶剂分类 第1 类溶剂:指已知可以致癌并被强烈怀疑对 人和环境有害的溶剂, 其残留量必须控制在规 定的范围内; 第2 类溶剂:指无基因毒性但有动物致癌性的 溶剂; 第3 类溶剂:指对人体低毒的溶剂。在无需论 证的情况下, 残留溶剂的量不高于0.5
4、% 是可 接受的, 但高于此值则须证明其合理性; 第4 类:尚无足够毒理学资料的溶剂。 7 有机溶剂的分类 类别毒性 PDE（mg/天 ） 第一类溶剂 人体致癌物、疑为人体 致癌物或环境危害物 0.1以下(1,1,1) 三氯乙烷除外 第二类溶剂 有非遗传致癌毒性或其 他不可逆毒性、或其他 严重的可逆毒性 0.5-50 第三类溶剂对人体低毒50 第四类溶剂没有足够毒性资料 8 限度的制定 残留量表示方法：浓度限度 计算公式： 浓度限度（%）PDE/(1000剂量) 100% 其中：PDE：mg/天 剂量：一般为10g/天 9 质量标准的制订和修订 PDE、浓度限度的比较 PDE值：绝对值，控制精
5、确，但可能忽略多 种溶剂的综合影响。 浓度限度：以PDE为基础，并采用比较大的 每天给药量计算，给出了一个比较大的安全 系数。 目前情况下，采用浓度限度比较简便，而且 只要日摄入总量不超过10g，就无需进一步计 算。 10 药物中有机溶剂的引入 研究对象：原料药/辅料、制剂 原料药/辅料：合成过程中引入 包括： 作为合成原料或反应溶剂引入 作为反应副产物引入 由其他合成原料或其他溶剂带入 制剂 各种成份（原料药、辅料）带入 制剂制备过程中引入 制剂制备过程中引入（缓、控释微丸包衣过程使用 有机溶剂；难溶性药物固体分散 ）他克莫司溶于无水乙醇和二 氯甲烷中分散。 11 药物中有机溶剂的引入 研究
6、集中在：原料药的第一种情况 影响因素： 有机溶剂在合成过程中使用的步骤 后续溶剂的影响 中间体的影响 其他（如副反应等） 有机溶剂的使用和残留与合成工艺密不可分，是评 价合成工艺优劣，筛选、确定合成工艺的重要因 素之一。 12 药物中有机溶剂的引入 第一类溶剂 原则：考虑其毒性，建议尽量避免使用。 当合成路线涉 及此类溶剂时 合成化学发展水平判断使用 是否合理 合理 不合理 严格控制残留量 替代研究 临床研究前 临床研究期间 产品上市后 13 确定何种溶剂需进行研究的原则 意义和目的 保障临床用药安全，控制产品质量 与其他方面研究工作密不可分 进一步验证工艺控制的合理性 为确定合理可行的质量标
7、准提供数据支持 思考的出发点 有机溶剂的毒性 产品的合成工艺 14 确定何种溶剂需进行研究的原则 EMEA 第一类溶剂：不宜使用。一旦作为起始原料、溶 剂，或者反应副产物，或者由其他溶剂带入时， 残留量需符合ICH相关规定。 残留量控制方法：随引入情况不同而不同 直接控制终端产品 控制中间体 控制引入第一类溶剂的物质 15 确定何种溶剂需进行研究的原则 EMEA 第二类溶剂：可直接对终产品进行控制，可对中 间体进行控制，结果需符合ICH相关规定 当6批试生产规模或者3批生产规模的中间体检测 结果显示残留量低于ICH规定限度的十分之一时 ，可不对终产品进行控制。 16 确定何种溶剂需进行研究的原
8、则 研究原则： 考虑到各类有机溶剂有毒性和在终产品中残留的 可能性，建议： 第一类溶剂：无论任何步骤使用，均需进行检测 第二类溶剂：无论任何步骤使用，均需进行检测 第三类溶剂：建议可仅对用于终产品精制的此类溶剂 进行研究。 17 确定何种溶剂需进行研究的原则 研究原则： 第四类溶剂 若结构与毒性大的溶剂非常接近，建议尽量不 使用 注意中间体的处理，尽量除尽 根据结构和理化性质，参考其他的有机溶剂的 检测方法进行检测和控制 注意检测图谱中未知峰的情况，尽量进行归属 ，若无法归属，可以控制挥发性杂质总量。 18 若国家标准中未控制残留溶剂，建议根据起始原料 的制备工艺，对可能存在的残留溶剂一并在终
9、产品 中进行控制。 如果采用尚未批准的原料药、化工中间体等作为 起始原料，建议根据起始原料的制备工艺，对可 能存在的残留溶剂一并在终产品中进行控制。 19 9质量标准建立 附录中无限度规定和未收载的有机溶剂: 如在药物的制备过程中使用到了这类溶剂， 建议药物研发者尽量检索有关的毒性等研 究资料，关注其对临床用药安全性和药物 质量的影响。 20 表1 药品中常见的残留溶剂及限 度 第一类溶剂（应该避免使用） 溶剂名称 英文名 限度（ppm) 苯 Benzene 2 四氯化碳Carbon tetrachloride4 1，2二氯乙烷1,2-Dicloroethane 5 1，1-二氯乙烯1,1-D
10、ichloroethene 8 1，1，1三氯乙烷 1,1,1-Trichloroethane 1500 21 第二类溶剂（应该限制使用） 溶剂名称英文名浓度限度（ppm) 乙腈Acetonitrile410 氯苯Chlorobenzene360 氯仿Chloroform60 环己烷Cyclohexane 3880 1，2二氯乙烯1,2-Dichloroethene1870 二氯甲烷Dichloromethane600 1，2二甲氧基乙烷1,2-Dimethoxyethane 100 22 第二类溶剂（应该限制使用） N,N-二甲氧基乙酰胺N,N-Dimethylacetamide 1090
11、N,N-二甲氧基甲酰胺N,N-Dimethylformamide 880 1，4二氧六环1,4-Dioxane 380 2乙氧基乙醇2-Ethoxyethanol160 乙二醇Ethyleneglycol62 甲酰胺Formamide220 正己烷Hexane290 甲醇Methanol3000 2甲氧基乙醇2-Methoxyethanol50 甲基丁基酮Methylbutyl ketone50 甲基环己烷Methylcyclohexane 1180 23 第二类溶剂（应该限制使用） N-甲基吡咯烷酮N-Methylpyrrolidone4840 硝基甲烷Nitromethane50 吡啶Py
12、ridine200 四氢噻砜Sulfolane160 四氢化萘Tetralin100 四氢呋喃Tetrahydrofuran720 甲苯Toluene890 1，1，2三氯乙烯1,1,2-Trichloroethene80 二甲苯Xylene2170 通常含有60间二甲苯，14对二甲苯，9邻二甲苯和 17乙苯 24 第三类溶剂（GMP或其它质控要 求限制使用） 溶剂名称英文名浓度限度（ppm) 乙酸 Acetic acid5000 丙酮 Acetone 5000 甲氧基苯Anisole 5000 正丁醇1-Butanol5000 仲丁醇2-Butanol5000 乙酸丁酯Butyl aceta
13、te5000 叔丁基甲基醚 tert-Butylmethyl ether5000 异丙基苯Cumene5000 二甲亚砜Dimethyl sulfoxide5000 乙醇 Ethanol 5000 乙酸乙酯Ethyl acetate5000 乙醚 Ethyl ether5000 甲酸乙酯Ethyl formate 5000 25 第三类溶剂（GMP或其它质控 要求限制使用） 甲酸 Formic acid5000 正庚烷Heptane 5000 乙酸异丁酯Isobutyl acetate5000 乙酸异丙酯Isopropyl acetate5000 乙酸甲酯Methyl acetate5000
14、3甲基1丁醇3-Methyl-1-butanol5000 丁酮 Methylethyl ketone5000 甲基异丁基酮 Methylidobutyl ketone5000 异丁醇2-Methyl-1-propanol5000 正戊烷Pentane 5000 正戊醇1-Pentanol5000 正丙醇1-Propanol5000 异丙醇2-Propanol5000 乙酸丙酯Propyl acetate5000 26 第四类溶剂（尚无足够毒理学资 料） 溶剂名称英文名 1，1二乙氧基丙烷 1，1Diethoxypropane 1，1二甲氧基甲烷 1,1-Dimethoxymethane 2，2
15、二甲氧基丙烷 2,2-Dimethoxypropane 异辛烷Isooctane 异丙醚Isopropyl ether 甲基异丙基酮Methylisopropyl ketone 甲基四氢呋喃Methyltetrahydrofuran 石油醚Petroleum ether 三氯乙酸Trichloroacetic acid 三氟乙酸Trifluoroacetic acid 27 残留溶剂测定方法 干燥失重：专属性差 GC法(普通)：首选方法 顶空进样法 直接进样法 HPLC法：例如测定吡啶 离子色谱法：测定N-甲基吡咯烷酮 气质联用 28 有机溶剂残留量测定方法分类 1.直接进样法 适用范围：沸点
16、高溶剂或受热不易分解样品。 优点：简便、无需专用设备，绝对进样量大。 缺点：污染进样口及柱子，溶剂峰响应大，样 品分解产物或溶剂杂质峰可能影响测定，对 溶剂的纯度要求高。 29 2.顶空进样法（Headspace Analysis) 2.1 静态顶空技术 2.2 动态顶空技术（吹扫捕集法） 适用范围：沸点低溶剂或样品本身对测定有影响。 优点：在较低温度下进行，避免组分分解；减少溶解 样品的溶剂量和样品本身对色谱系统的干扰和污染 ，增加色谱柱的寿命。 缺点：需要特定的顶空进样装置，成本较高，对沸点 较高的溶剂检测灵敏度不够，一般多应用于沸点 100以下的溶剂。 30 顶空进样法的原理 顶空分析是
17、通过样品基质上方的气体成 分来测定这些组分在原样品中的含量。这是 一种间接的分析方法，其基本理论是在一定 条件下气相和凝聚相（液相或固相）之间存 在着分配平衡。所以气相的组成能反映凝聚 相的组成。 31 32 33 34 35 当样品的蒸气压相当低时，色谱峰面积(Ai)与 挥发性组分（i）的蒸气压（Pi)成正比 Ai=CiPi Ci与物质种类及检测器有关的特定常数。 36 对于理想混合体系，依据拉乌尔定律： Pi=iP0iXi P0i为纯组分（i）的蒸气压，Xi为组分（i）的摩尔 分数,i组分的活度系数。 37 服从拉乌尔定律的混合体系，其峰面积与 浓度成线性关系。但在高浓度区域内分压的 变化
18、与浓度变化不成线性关系，有时甚至与 浓度无关。如果不注意这一点，顶空分析会 得到错误的结果。 因此分析中定量校正尤为重要。在很多情 况下，样品溶液若能充分稀释，则能使其接 近理想体系，服从拉乌尔定律。 38 39 顶空进样法的特点 、样品不需要前处理，它只取气相部分 进行分析，大大减少了样品基质对分析的 干扰。 、进样量大，灵敏度高，可用于痕量有 机挥发性物质的测定。 、对于易挥发或易分解和无法直接进样 分析的液体或固体样品而言，更有它的实 用价值。除分析中草药中挥发性成分外， 还常用于固体药物、包装材料、药物的残 留溶剂分析 40 顶空分析可以看成是一种气相萃取方法 ，即用气体作“溶剂”来萃
19、取样品中的挥发性成 分，因而顶空分析就是一种理想的样品净化 方法。 传统的液液萃取及SPE都是将样品溶解 在液体中，不可避免地会有一些共萃取物干 扰分析。 41 静态顶空分析装置 手动进样装置 42 采用手动进样时，所需设备简单，只要有一 个控温精确的恒温槽和顶空瓶。 将装有样品的顶空瓶置于恒温槽中，在一定 的温度下达到平衡后，就可用注射器从容器 中抽取顶空气体，注入GC进行分析。 43 手动进样的的两个缺点 1.压力控制难以实现。 2.温度的控制，注射器的温度低时，某些沸 点高的样品组分很容易冷凝。 由于上述原因，手动进样的准确度差，分 析重现性难以保证。 在只作定性分析时，手动进样不失为一
20、种 经济的方法，要作精确的定量分析最好用自 动顶空进样装置。 44 自动顶空进样装置 45 自动顶空进样装置 46 顶空进样器工作原理 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 影响顶空分析的因素 1.样品的性质 顶空气体中单个组分的含量既与其本身的 挥发性有关，又与样品基质有关。特别是那 些在样品基质中溶解度大（分配系数大）的 组分，“基质效应”更为明显。 标准溶液必须有与原样品相同或相似的基 质，否则，定量误差将会很大。 57 一些消除或减少基质效应的方法 （1）利用盐析作用 在水溶液中加入无机盐 （如硫酸钠）来改变挥发性组分的分配系 数。但当盐浓度小于5%时几乎没有作用
21、，故 常用高浓度的盐，甚至用饱和浓度。盐析作 用对极性组分的影响大于非极性组分的影 响。此外，在水溶液中加入盐之后，溶液体 积会变化，定量线性范围可能变窄。 58 一些消除或减少基质效应的方法 （2）在有机溶液中加入水，当然，水要与 有机溶剂相溶。这可以减少有机物在有机溶 剂中的溶解度，增大其在顶空气体的含量。 分析灵敏度可增加几倍数百倍。 （3）调节溶液的pH 对于碱和酸，通过控 制pH可使其解离度改变，或使其待测物的挥 发性变的更大，从而有利于分析。 （4）样品应溶解在合适的溶剂中，一般可 用水、DMF、DMSO或其混合溶剂作溶媒。 59 2.样品体积 顶空瓶中的样品体积对分析结果影响很大
22、 ，因为它直接决定相比。 Cg=Co/(K+ ) 其中=Vg/VL ，K=CL/Cg 对于一个给定的气液平衡系统，K和Co为 常数， 与顶空气体中的浓度成正比。 样品体积VL增大， 减少，Cg增大，灵敏 度增加。但对于具体的 样品体系，还要看K 的大小。当K 时，样品体积的改变对分 析灵敏度影响小。当K时，影响就很 大。 60 顶空分析是只从样品瓶中取样一次，每 份样品体积是否重现影响分析结果。 待测组分的分配系数越小（在凝聚相中 溶解度越大），样品体积波动所造成的结果 误差越大；反之越小。 61 3.平衡温度 样品的平衡温度与蒸气压直接相关，它影 响分配系数。 温度越高，蒸气压越高，顶空气体
23、的浓度 越高，分析灵敏度越高。待测组分的沸点越 低，对温度越敏感。因此，顶空分析特别适 合于分析样品中的低沸点成分。 62 温度对顶空分析灵敏度的影响 水中溶解性越好,平衡温度越敏感。 63 4.平衡时间 平衡时间取决于组分分子从样品基质到气 相的扩散速度。扩散速度越快，所需时间越 短。扩散系数与分子大小、介质黏度及温度 有关。温度越高，黏度越低，扩散系数越 大。所以，提高温度可以缩短平衡时间。 64 与样品瓶有关的因素 1.样品瓶 要求体积准确，能承受一定的压力，密封 性能好，对样品无吸附。 样品瓶的体积有520ml多种，具体选用 那种，要根据仪器及样品情况而定。 顶空瓶若要反复使用，可用洗
24、液浸泡，然 后用蒸馏水冲洗，最后置烘箱中烘干。 65 2.密封垫 密封垫的材料主要有三种：硅橡胶、 丁基橡胶、氟橡胶。 硅橡胶垫耐高温、丁基橡胶垫价格 低、氟橡胶垫惰性好。 为防止密封垫对样品组分的吸附，现 在多用内衬聚四氟乙烯或铝的密封垫。 选用时要看分析条件（温度）和样品 具体情况而定。常规分析可用价格低的 丁基橡胶垫 ，痕量分析则最好选用有内 衬的硅橡垫胶。 66 顶空分析方法开发的步骤 1 .确定如何处理样品。如待测组分挥发性太低， 则可用直接进样测定。考虑用何种溶剂溶解。 2. 根据待测组分确定分析条件-色谱柱、检测 器、及操作条件。通过标准样品进样分析来优化 分离条件。 3. 确定平衡时间和平衡温度。 4. 样品的分析，主要考察灵敏度是否满足要求。 通过改变分流比、顶空取样条件（改变进样时间 或定量管）来控制信号的大小。改变平衡温度、 相比、消除基质效应以提高分析灵敏度。 5.对测定方法进行方法学验证线性、回收 率、精密度、
