1、入普通冰箱，等待观察检查。7将感染病毒的鸡胚自冰箱中取出，用碘酒消毒人工气室面，然后用镊子撕去胶布并将卵壳的三角形窗口扩大，以便剪取绒毛膜，此时在明亮处可清楚地看到牛痘斑，呈白色点状，有时融合成一堆或一片。8左手用小镊子镊起绒毛尿囊膜，右手用小剪顺卵壳四周剪下绒毛尿囊膜放入无菌培养皿内，并用无菌生理盐水洗涤12次，再将膜张开，膜上牛痘斑就看得更为清楚。绒毛尿囊膜上接种法，除适用于天花，牛痘等病毒外，尚适用于单纯疱疹病毒和其它一些病毒，但其它一些病毒不如天花、牛痘、单疱疹病毒那样具有明显的病斑。绒毛尿囊膜羊水卵白卵黄囊尿囊液图10-2 鸡胚绒毛尿囊膜上接种（三）羊膜腔接种法（录像）【材料】副流感
2、病毒103稀释液、910日龄鸡胚、灭菌液体石蜡、其余同尿囊腔接种法。【方法】1所用鸡胚在使用前一天，将鸡胚直立卵盘培养，使其胚胎向上，便于操作。 2接种前检查鸡胚生活情况，并用铅笔画出天然气室和胚胎的位置，然后用磨蛋器沿天然气室的边缘和胚胎位置近处，锯一方形小窗（每边约1厘米许，如图10-3）。3用小镊子挑去方形卵壳和撕去卵膜，再用无菌吸管，吸取石蜡油少许，滴入2滴，石蜡油在气室面的卵膜上很快散开，使膜透明，这样在鸡蛋照明灯或检蛋灯上，可清楚地观察到整个鸡胚。4用无菌1毫升注射器抽取少许流感病毒液体，将鸡蛋直立于照明灯或检蛋灯上，针头自窗口对着鸡胚直下，穿过绒毛尿囊膜，羊膜腔、推动注射器，注入
3、0.10.2毫升，针头刺入时注意勿伤及鸡胚本身，最好从小鸡的颈部空隙中插入。5注射完毕后，用胶布封口（胶布先经碘酒消毒和通过火焰烧去余碘处理）。用过的注射器煮沸消毒处理。鸡胚放入3537培养4872小时。6自注射后次日起逐日检查鸡胚的生活情况，2日以内死亡者多为非特异性损伤而致死；2日后死亡者视为特异性死亡，流感或副流感病毒103稀释注射时，一般不引起死亡。收获病毒之前将鸡胚移入普通冰箱1824小时，将鸡胚冻死，以减少收获时的出血。7冰箱取出鸡胚，碘酒消毒鸡蛋气室端，撕去胶布并将蛋壳窗口扩大，用小镊子撕破卵膜及绒毛尿囊膜，然后用毛细管吸出尿囊液弃去，尿囊液吸完后，左手持镊子镊住羊膜腔，右手以毛
4、细吸管插入羊膜腔吸取羊水，一般羊水可吸出一毫升左右。8滴定羊水的病毒血凝效价。羊膜腔接种方法适用于一些呼吸道病毒，如流感病毒、副流感病毒及流行性腮腺炎病毒等的分离。 卵黄囊气室卵白羊水尿囊液图 10-3羊膜腔接种法四、病毒细胞培养法及病变观察（录像）细胞培养法是目前培养病毒应用最广的一种培养方法，其优点是（1）经济适用，结果正确且敏感；（2）较实验动物易于控制。细胞培养法多应用于病毒的分离培养，进行血清中和试验及制造疫苗和抗原等方面。很多组织细胞，包括鸡胚、鼠胚、各种动物的肾组织细胞，人胚羊膜组织细胞或流产胎儿组织细胞（应在死后6小时内采取，因时间过长，组织细胞生长成功率下降）等均可作细胞培养
5、的来源。细胞的选择主要依据组织细胞对病毒的敏感性。能引起病变的组织细胞，往往取自病毒的自然宿主，特别是引起疾病的宿主的某些脏器组织细胞。人类病毒，用人或猴的组织细胞较敏感，但这不是绝对的，如地鼠肾细胞较人肾细胞对流行性乙型脑炎病毒敏感。（一） 原代细胞培养法【材料】910日龄鸡胚、Hanks氏溶液、0.25胰酶溶液、无菌小剪、镊子、无菌培养皿、毛细吸管、吸管、沉淀管、无菌细胞培养管（抗生素空瓶）、100毫升无菌玻璃瓶或三角烧瓶、备有四层纱布的玻璃漏斗。【方法】1用碘酒消毒鸡胚蛋气室外壳，并将它直立于蛋架上，以镊子将鸡胚取出放入无菌培养皿内，去头爪及内脏。2用小剪在培养皿内将胚胎剪成小块（45毫
6、米3），加Hanks氏溶液（约10毫升）冲洗，静置12分钟后，用毛细吸管吸取液体。依同法再洗涤2次，将血球充分洗去。3用镊子将组织块放入无菌玻璃瓶或三角烧瓶内，加入1015毫升0.25胰酶溶液，37水浴20分钟，中间摇动几次。由于胰酶的作用可使大量细胞游离，液体变混。经四层纱布过滤后的细胞悬液，低速离心沉淀（1000转/分以内）5分钟，吸取上清液，沉淀物加入适量营养液，用白细胞计数的方法进行计数，使成每毫升含5080万细胞悬液以作单层细胞培养。4每一细胞培养管，注入细胞悬液1毫升，盖好瓶塞，并将瓶略加摇动，横卧于有槽木架上，使细胞均匀平铺于管壁。置37温箱孵育，一般4小时，细胞附着于管壁，48
7、小时可长成单层，此时即可调换营养液，接种病毒。（二） 传代细胞培养法从人及动物组织，特别是肿瘤组织，经过多次传代可建立传代细胞系。这种细胞能无限地传代，但并不是所有的组织细胞都能建立传代细胞。有一些传代细胞对病毒敏感范围较广，曾被利用作病毒的分离和鉴定。如HeLa细胞，Hep2细胞及KB细胞。HeLa细胞对脊髓灰质炎三型病毒，腺病毒及大多数实验室适应的ECHO病毒都敏感。Hep2细胞也曾用来分离脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A组病毒、腺病毒、RS病毒。HeLa细胞来自子宫颈癌，Hep2细胞来自喉癌，而KB细胞来自上腭癌。由于传代细胞有致肿瘤作用，目前仅用做病毒的分离鉴定及一些病毒学的研究而不能用于疫苗
8、的生产。【材料】单层细胞培养瓶，营养液，0.25胰蛋白酶溶液，无菌吸管，无菌细胞瓶。【方法】1将成片细胞的生长液倒掉，用Hanks液洗一次。2加入适量的0.25胰蛋白酶，37孵育1分钟。3将细胞瓶倒放，细胞在上，胰酶在下，继续孵育37510分钟。4将胰蛋白酶倒掉，再加入原量的生长液，用10毫升吸管吹打分散细胞。5用生长液按原量34倍稀释，即一瓶细胞能传34瓶。（三） 细胞培养接种病毒的方法及病变观察（示教）【材料】单层细胞培养管、营养液、Hanks溶液、无菌毛细滴管和腺病毒稀释液。【方法】1取已长成单层细胞的培养瓶二只，用无菌毛细滴管吸去管中液体，用Hanks溶液洗二次。2用无菌的1毫升吸管吸
9、稀释的腺病毒液0.1毫升加入一只单层细胞培养瓶中，另一只加0.1毫升营养液不接种病毒作为对照，细胞瓶放平，使其接触整个细胞层，置37作用1小时，使病毒吸附到细胞上。3取出单层细胞瓶，每只中加入营养液0.9毫升，盖紧后置37孵箱中培养12天。4取出细胞在低倍显微镜下观察，注意种毒与对照二管的细胞形态，排列等。注：为方便保存，此处观察的细胞已经过固定和染色。五、血凝抑制试验血凝抑制试验系利用血凝素特异性抗体与病毒表面相应血凝素相互作用，使病毒血凝现象抑制的试验。血凝抑制试验适用于具有血凝素的病毒，试验必须预先滴定病毒的血凝效价，然后采用一定量的病毒，通常是加入4个血凝单位的病毒，在与血凝滴定试验相
10、同的反应条件下来进行测定。（一）血凝效价的滴定【材料】收获的尿囊液（病毒悬液）、32孔有机玻璃板。0.2 ml移液器、移液头、小试管一支、0.5鸡红细胞悬液、生理盐水【方法】按下表进行，其操作程序为：1将有机玻璃板孔从110号进行编号，从第一孔起直至第10孔，每孔加生理盐水0.2ml。2将尿囊液在试管中作15稀释，即吸取0.8ml生理盐水，加入0.2ml尿囊液。然后吸取15稀释的尿囊液0.2 ml加入到第1孔，混匀后（吹吸3次），从中吸出0.2 ml移入第2孔，如此对倍稀释直至第9孔，于第9孔中吸出0.2 ml，弃入消毒缸内。第10孔不加尿囊液作为对照。3自第10孔起，反方向每孔补充生理盐水0.2 ml。1 自第10孔起，反方向每孔加入0.5 鸡红血球0.4 ml，摇匀后放室温静止45分钟，观察结果，并确定血（球）凝（集）效价。孔 号12345678910生 理 盐 水（ml）尿 囊 液（ml）0.2+0.2 *0.2+0.20.2+0.20.2+0.20.2+0.20.2+0.20.2+0.20.2+0.20.2+0.20.20.2弃去病 毒 稀 释 度11 012 014 018 01160132016401128012560对 照补 充 液（ml）（生 理 盐 水）各 0.20.5 鸡 红 细 胞悬
