1、ICS 11.080 C 50 WS 中华人民共和国卫生行业标准 WS/T 650 2019 抗菌和抑菌效果评价方法 Evaluting Method for Efficacy of Antibacterial and Bacteriostasis 2019 - 01 - 30 发布 2019 -07 - 01 实施 中华人民共和国国家卫生健康委员会 发布 WS/T 650 2019 I 前 言 本标准按照 GB/T1.1-2009的规定进行编写 。 本标准由江苏省疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、山东省疾病预防控制中心、黑龙江省疾病预防控制中心负责起草。 本标准
2、主要起草人 ：徐燕、谈智、张流波、陈越英、吴晓松、林玲、孙启华、崔树玉、赵华伟、吴克、张文生、王裕荣、吴晓、沈瑾、李炎、孙巍、王玲、王嵬、王晓蕾、褚宏亮。 WS/T 650 2019 1 抗菌和抑菌效果评价方法 1 范围 本标准规定了抗菌和抑菌评价方法的选择原则和使用。 本标准适用于具有抗菌和 (或 )抑菌功能产品的抗菌、抑菌效果的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日 期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 15979 一次性使用卫生用品卫生标准 FZ/T 73023 抗菌针织
3、品 消毒技术规范 （ 2002版） 卫生部（卫法监发 2002 282号） 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 抗菌 antibacterial 采用化学或物理方法杀灭或妨碍细菌生长繁殖，可减少其数量以及活性的过程。 3.2 抑菌 bacteriostasis 采用化学或物理方法抑制或妨碍细菌生长繁殖及其活性的过程。 3.3 持续抗菌作用 sustained antibacterial action 具有抗菌作用的消毒产品涂于物体表面，持续 7d以上仍具有杀灭或妨碍细菌生长繁殖作用。 3.4 中和剂 neutralizer 在杀灭微生物试验中，用以消除试验微生物与消毒剂的混悬
4、液中，以及微生物表面上残留的消毒剂，使其失去对微生物抑制和杀灭作用的试剂。 4 评价方法的选择原则 WS/T 650 2019 2 4.1 抗菌试验与抑菌试验区别 抗菌试验：测定抗菌产品对细菌和真菌的抗菌作用，试验过程中需要用中和剂终止杀菌作用。 抑菌试验：测定抑菌产品对细菌和真菌的抑菌作用，试验过程中不需 要使用中和剂终止抑菌作用。 4.2 根据产品性能选择合适的评价方法 4.2.1 抑菌效果评价方法的选择原则 抑菌类产品选择抑菌效果评价方法。液体抑菌产品选择悬液定量抑菌试验，膏体或半固体凝胶类、黏稠状抑菌产品选择载体浸泡定量抑菌试验，湿巾类或其他自身含有抑菌成分的产品选择载体抑菌试验，肥皂
5、类固体抑菌产品选择抑菌环试验，含有可溶性抑菌成分的纺织品选择浸渍抑菌试验，含有持续抑菌作用的抑菌洗液选择滞留抑菌试验。 4.2.2 抗菌效果评价方法的选择原则 抗菌类产品选择抗菌效果评价方法。液体抗菌产品选择悬液定量杀菌试验，凝胶状或膏状抗菌产品选择载体 浸泡定量杀菌试验，湿巾类或其他自身含有抗菌成分的产品选择载体杀菌试验，含有可溶性抗菌成分的纺织品选择浸渍抗菌试验。 含有不可溶抗菌成分的纺织品、无纺布、纤维等，经鉴别不含可溶性抗抑菌成分后，采用烧瓶振荡试验。 含有不可溶抗菌成分的瓷砖、塑料、金属、涂料等，采用贴膜试验；对于涂于表面，干燥后具有持续抗菌作用的产品，进行持续抗菌试验。 5 评价方
6、法 5.1 抑菌效果 5.1.1 悬液定量抑菌试验 5.1.1.1 适用范围 适用于液体抑菌制剂如卫生洗液、抑菌喷雾剂等对微生物抑菌效果的测定。 5.1.1.2 试剂、培养基及器材 5.1.1.2.1 试验菌株 金黄色葡萄球菌（ ATCC 6538）、大肠杆菌（ 8099）、白色念珠菌（ ATCC 10231）及根据抑菌剂特定用途所用的其他菌株。 5.1.1.2.2 试剂 稀释液： 0.03 mol/L 磷酸盐缓冲液（ PBS）（ pH7.2 7.4），培养基：金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的培养使用营养琼脂培养基，白色念珠菌的培养使用沙氏琼脂培养基。 5.1.1.2.3 器材 恒温水浴箱、计时器、
7、级生物安全柜等。 5.1.1.3 试验步骤 WS/T 650 2019 3 取试验菌 24h新鲜斜面培养物用 PBS洗下，用 PBS稀释至约 5.0 105 CFU/mL 4.5 106 CFU/mL菌悬液备用。取无菌试管，先加入 5.0 mL样品（根据使用说 明书要求使用原液或稀释液），置 20 1 水浴中 5min后，再加入 0.1 mL试验用菌悬液，迅速混匀并立即计时。待试验菌与样品相互作用至说明书的规定时间，分别吸取 1.0 mL试验菌与样品混合液接种 2个平皿，倾注培养基。菌量无法计数时，以 PBS做 10倍系列稀释，选适宜稀释度分别吸取 1.0 mL接种 2个平皿，做活菌培养计数。
8、同时用 PBS代替样品，进行平行试验，作为阳性对照。阳性对照回收菌落数在 1.0 104 CFU/mL 9.0 104 CFU/mL之间。取同批次PBS、培养基作阴性对照。所有试验样本和对照样 本均在 36 1培养，细菌繁殖体培养 48h观察最终结果；白色念珠菌培养 72h观察最终结果。试验重复 3次，计算抑菌率。 5.1.1.4 抑菌率计算 %100010 A AAX . (1) 式中： X 抑菌率， %； A0 阳性对照组回收菌量，单位为 CFU/mL； A1 试验组回收菌量，单位为 CFU/mL。 5.1.1.5 结果判定 抑菌率 50% 90%，判有抑菌作用；抑菌率 90%，判有较强抑
9、菌作用。 5.1.2 载体浸泡定量抑菌试验 5.1.2.1 适用范围 适用于膏体或半固体凝胶类、黏稠状抑菌 产品对微生物抑菌效果的测定。 5.1.2.2 试剂、培养基及器材 载体为 10 mm 10 mm脱脂白平纹布片，脱脂方法依照消毒技术规范（ 2002版）进行，使用前压力蒸汽灭菌备用，电子天平（ d=0.01g），其它同 5.1.1.2。 5.1.2.3 操作步骤 取试验菌 24h新鲜斜面培养物用 PBS洗下，用 PBS稀释至约 5.0 106 CFU/mL 5.0 107 CFU/mL制成菌悬液备用。用微量移液器滴染 10 l菌悬液于灭菌载体上， 36 1烘干或室温晾干备用。 按 5 g
10、/片的量称取样品于无菌平皿内，置 20 1水浴 5min，用无菌 镊子取染菌载体，使载体完全浸没于样品中，立即计时。待染菌载体与样品相互作用至说明书的规定时间，分别取染菌载体加入 5.0 mLPBS试管中，混匀，振荡，将试验菌洗下，分别吸取 1.0 mL样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液接种 2个平皿。如平板上生长的菌落数较多时，可用 PBS进行 10倍系列稀释后，再进行活菌培养计数。取 10.0 g与试验样品同质材料不含抑菌成分的对照样品浸泡 2片染菌载体进行平行试验，作为阳性对照。阳性对照回收菌量为 1.0 104 CFU/片 9.0 104 CFU/片。取同批次 PBS、 培
11、养基作阴性对照。所有试验样本和对照样本均在 36 1培养，细菌繁殖体培养 48h观察结果；白色念珠菌培养 72h观察结果。试验重复 3次，计算抑菌率。 5.1.2.4 抑菌率计算 WS/T 650 2019 4 %100010 A AAX . (2) 式中： X 抑菌率， %； A0 对照样品的平均菌落数，单位为 CFU/片； A1 被试样品平均菌落数，单位为 CFU/片。 5.1.2.5 结果判定 抑菌率 50% 90%，判有抑菌作用；抑菌率 90%，判有较强抑菌作用。 5.1.3 载体抑菌试验 5.1.3.1 适用范围 适用于含溶出 性抑菌成分的湿巾、无纺布口罩、卫生巾、护垫、尿布等固体类
12、抑菌产品对微生物抑菌效果的测定。 5.1.3.2 试剂、培养基及器材 见 5.1.1.2。 5.1.3.3 试验步骤 取试验菌 24h新鲜斜面培养物用 PBS洗下，用 PBS稀释至约 105 CFU/mL 106 CFU/mL，制成菌悬液备用。用灭菌剪刀在无菌条件下将试验样品和对照样品分别剪成 20 mm 30 mm样片备用。试验时滴加 0.1 mL菌悬液。对照样片染菌前需经压力蒸汽灭菌。取无菌平皿，用无菌镊子取 2片试验样片，勿重叠，置 20 1水浴 5min，在每一样片上滴加 0.1 mL试验用菌 悬液，立即计时。待试验菌与样片接触作用至说明书的规定时间，分别夹取染菌样片加于 5.0 mL
13、PBS试管中，混匀。振荡洗脱，分别吸取 1.0 mL样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液接种 2个平皿。如平板上生长的菌落数较多时，可 10倍系列稀释后，再进行活菌培养计数。 同时用与试验样品同质材料不含抑菌成分的对照样片 2片代替试验样片进行试验，作为阳性对照，阳性对照回收菌量为 1.0 104 CFU/片 9.0 104 CFU/片；取同批次 PBS、培养基作阴性对照。 所有试验样本和对照样本均在 36 1培养，细 菌繁殖体培养 48h、白色念珠菌培养 72h观察最终结果。试验重复 3次，计算抑菌率。 5.1.3.4 抑菌率计算 见式（ 2）。 5.1.3.5 结果判定 抑菌率
14、50% 90%，判有抑菌作用；抑菌率 90%，判有较强抑菌作用。 5.1.4 抑菌环试验 5.1.4.1 适用范围 适用于含溶出性抑菌物质，可制成直径为 5 mm片状物的固体抑菌产品的抑菌效果鉴定；也可用于鉴别抗抑菌样品中是否含有可溶性抑菌物质。 WS/T 650 2019 5 5.1.4.2 试剂、培养基及器材 游标卡尺，其它见 5.1.1.2 5.1.4.3 试验步骤 将试验菌 24h新鲜斜面培养物用 PBS洗下，稀释至 5.0 105 CFU/mL 5.0 106 CFU/mL备用。 抑菌片的制备：溶出性固体抑菌产品，直接制成直径为 5 mm，厚度不超过 4 mm圆片（块），每 4片为一
15、组。 阴性对照样片的制备：取同种材质不含抑菌成分的样本，制成与试验组大小相同的圆片（块）。 用无菌棉拭子蘸取浓度为 5.0 105 CFU/mL 5.0 106 CFU/mL试验菌悬液，在适宜的培养基平板表面均匀涂抹 3次。每涂抹 1次，平板应转动 60，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温干燥 5min。 每次试验贴放 1个染菌平板，每个平板贴放 4片试验样片， 1 片阴性对照样片，共 5片。用无菌镊子取 样片贴放于平板表面，阴性对照样片贴于平板中心位置，试验样片贴于四周，贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。各样片中心之间相距 25 mm以上，与平板的周缘相距 15
16、 mm以上。盖好平板，置 36 1培养 16h 18h观察结果，试验重复 3次。 用游标卡尺测量抑菌环的直径（包括贴片）并记录，测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行，测量其直径应以抑菌环外沿为界。 5.1.4.4 结果判定 阴性对照样片应无抑菌环产生，试验样品抑菌环直径 7 mm者，判为有抑菌作用；抑菌环直径 7 mm者，判为无抑菌作用。 3次 重复试验（共 12个样片）均有抑菌作用，则判为合格。 5.1.5 浸渍抑菌试验 5.1.5.1 适用范围 适用于溶出性抑菌织物（如抑菌毛巾、口罩、内衣等）抑菌效果的测定。 5.1.5.2 试剂、培养基及器材 5.1.5.2.1 试验菌株见
17、5.1.1.2.1 5.1.5.2.2 试样 在距试样布边 10 cm以上、离布端 1 m以上部位，剪取直径为 5 cm的圆形试样若干，取 3份试样分别装于 3个锥形瓶中，盖好瓶口备用（需用试样数量要根据纤维类别及织物织法而定，以能吸收 1 mL菌液且锥形瓶中不留残液为度）。另同法剪取与试样相同材质但不含抑菌剂对照织物若干，取 2份分别装于 2个锥形瓶中，盖好瓶口， 121灭菌 15min备用。 5.1.5.2.3 试剂和培养基 0.03 mol/L PBS（ pH7.2 7.4），肉汤培养基、营养琼脂培养基、沙氏培养基。 5.1.5.2.4 菌悬液的制备 WS/T 650 2019 6 用接
18、种环将保存的菌种以划线法接种到营养琼脂平板， 36 1培养 24h，取典型的菌落移种到含肉汤培养基的锥形瓶中， 36 1培养 24 h，用肉汤对培养液进行系列稀释，使菌悬液的含菌量为 1.0 105 CFU/mL 5.0 105 CFU/mL。 5.1.5.3 试验步骤 分别取 1 mL菌悬液加入 2份准备好的锥形瓶内试样和 1份对照织物上，确保其均匀分布，且锥形瓶中不留多余液， 封好瓶口，以防蒸发造成细菌死亡。分别在一个盛有已接种菌悬液的试样和对照织物的锥形瓶中加入 100 mLPBS，置涡旋振荡器上振荡 1min洗涤细菌，分别吸取 1.0 mL样液或 10倍系列稀释液接种 2个平皿，作为“
19、 0”接触时间样本和对照织物上的细菌数。 将另一个装有已接种菌悬液试样的锥形瓶于 36 1培养 20h 2h，加入 100 mLPBS，置涡旋振荡器上振荡 1min洗涤细菌，分别吸取 1.0 mL样液或 10倍系列稀释液接种 2个平皿，作为试验组。 阴性对照组，试样不接种菌悬液，在“ 0”接触时间加入 100 mLPBS，置涡旋振荡器上振荡 1min取样，接种平皿。 阳性对照组，另取 1个装有对照织物的锥形烧瓶，接种 1 mL菌悬液后，在 36 1培养 20 h 2h，加入 100 mLPBS，置涡旋振荡器上振荡 1min洗涤细菌，分别吸取 1.0 mL样液或 10倍系列稀释液接种 2个平皿。
20、将阴性和阳性对照样本与试验组样本一并放 36 1培养 48h，计数菌落数，试验重复 3次。 5.1.5.4 计算抑菌率 %1002/)(C 2/)(C CBB ACBBX 或或 或或. (3) 式中： X 抑菌率， %； A 试验组试样 上的细菌数，单位为 CFU/mL； B “ 0”接触时间试样上的细菌数，单位为 CFU/mL； C “ 0”接触时间对照织物上的细菌数，单位为 CFU/mL； 如果“ B”和“ C”差别较大时，取较大值；如果“ B”和“ C”差别不大时，取平均值。 5.1.5.5 结果判定 试验成立条件要求：“ 0”接触时间对照织物的平均回收菌量为 1 103 CFU/mL
21、5 103 CFU/mL；阴性对照应无菌生长，阳性对照菌数比 0接触时间的菌数明显增加。 各次试验的抑菌率均 50%，即可判定该样片具有抑菌作用。 5.1.6 滞留抑菌效果试验 5.1.6.1 适用范围 适用于 有持续抑菌作用的抑菌洗液类抑菌产品的滞留抑菌效果鉴定。 5.1.6.2 试剂、培养基及试验器材 试验菌株：金黄色葡萄球菌（ ATCC 27217） 试验产品 : 试验品为 25套按顺序编号的样品。每套 2瓶，一瓶为测试样品，另一瓶为不含抗（抑）菌剂的对照样品。 不含抑菌剂的用品 25瓶（试验调整阶段用）。 WS/T 650 2019 7 胰蛋白酶大豆肉汤培养基（ TSB）、胰蛋白酶大豆琼脂培养基（ TSA）、羊血、经脱纤维处理、 0.075 mol/L的磷酸盐缓冲液、 70%酒精、金属筒 （直径 2.2 cm、高度 3 cm）、一次性接种环（直径 4 mm）、小塑料碗（直径 2.2 cm，高 2.5 mm,）、胶带（ Darapore,3M公司生产）、尼龙刮菌棒、 聚乙二醇单辛基苯基醚 (曲拉通 X-100； Trito
