1、的要求。6DB21/T 18362010表 4 多孔砖强度等级抗压强度 fc /MPa强度等级平均值 fcm 单块最小值 fcminMU10 10.0 8.0MU7.5 7.5 6.06.4 吸水率最大质量吸水率应不大于 20%。6.5 干燥收缩率干燥收缩率应不大于 0.05%。6.6 抗冻性抗冻性 5 块试样平均值应符合表 5 的要求。表 5 抗 冻 性使 用 条 件 抗冻指标 强度损失率 % 质量损失率 %辽 宁 地 区 F50 20 2.0注：F50 指冻融循环 50 次。6.7 碳化系数碳化系数应不小于 0.85。6.8 软化系数软化系数应不小于 0.85。6.9 放射性放射性核素限量
2、应符合 GB 6566 的要求。7 试验方法7.1 尺寸偏差试验样品数为 20 块，其方法按 GB/T 2542 的规定进行。其中每一尺寸测量不足 0.5mm 按 0.5mm计，每一方向尺寸以两个测量值的算术平均值表示。7.2 外观质量检验按 GB/T 2542 的规定的方法进行。7.3 强度等级7.3.1 实心砖7DB21/T 183620107.3.1.1 抗压强度试验按 GB/T 2542 规定的方法进行。其试样数量为 10 块，加荷速度为（50.5）kN/s。试验后按式（1） 、式（2）分别计算出强度标准差 、变异系数 。C（1）1029icmifcmfC（2）式中： 10 块试样的抗
3、压强度标准偏差，单位为兆帕（MPa） ，精确至 0.01MPa；fcm 10 块试样的抗压强度平均值，单位为兆帕（MPa） ，精确至 0.01MPa；fi 单块试样抗压强度测定值，单位为兆帕（MPa） ，精确至 0.01MPa； 强度变异系数，精确至 0.01。C7.3.1.2 抗折强度试验按 GB/T 2542 规定的方法进行。其试样数量为 5 块。试验后计算抗折强度平均值 ftm，并应按式（3）计算折压比 。= （3）ftm试中：折压比，精确至 0.01；ftm5 块试样抗折强度平均值，单位为兆帕（MPa） ，精确至 0.01MPa；f相应强度等级的公称值，单位为兆帕（ MPa） 。7.3
4、.1.3 计算结果与评定7.3.1.3.1 平均值标准值方法评定变异系数 0.21时，按表 3 中抗压强度平均值 fcm、强度标准值 fck 和折压比 ，评定实心砖的强C 度等级。样本量 n=10 时的强度标准值按式(4)计算。 （4）83.1cmkf式中：fck强度标准值，单位为兆帕（MPa） ，精确至 0.1MPa。7.3.1.3.2 平均值最小值方法评定变异系数0.21 时，按表 3 中抗压强度平均值 fcm、单块抗压强度最小值 fc min和折压比 ，评定实心砖的强度等级。87.3.2 多孔砖试样数量为 5 块，抗压强度按附录 B 规定的方法进行。7.4 吸水率吸水率试验按 GB/T
5、4111 规定的方法进行。DB21/T 183620107.5 干燥收缩率干燥收缩率试验按附录 C 规定的方法进行。7.6 抗冻性抗冻性按附录 D 规定的方法进行。 7.7 碳化系数、软化系数碳化系数、软化系数试验按 GB/T 4111 规定的方法进行。7.8 放射性放射性试验按 GB 6566 规定的方法进行。8 检验规则 8.1 检验分类产品检验分出厂检验和型式检验。8.1.1 出厂检验产品出厂，应进行出厂检验。出厂检验的项目包括尺寸偏差、外观质量、强度等级、吸水率。8.1.2 型式检验 型式检验项目为本标准技术要求的全部项目。有下列之一情况者，应进行型式检验。a 新产品的投产鉴定；b 正
6、常生产后，原材料、配比及生产工艺改变；c 正常生产时，半年至少进行一次（放射性检验每年进行一次） ；d 产品停产三个月以上恢复生产时；e 出厂检验结果和上次型式检验有较大差异时；f 国家质量监督机构提出进行型式检验要求时。8.2 组批规则检验批的构成原则和批量大小按 JC/T466 规定，以同一品种原材料及配比制成、同一工艺生产的相同外观质量和强度等级的 10 万块蒸压粉煤灰砖为一批，不足 10 万块的按一批计。8.3 抽样规则8.3.1 外观质量检验的试样应用随机抽取法，从每一检验批的产品堆垛中抽取，8.3.2 其它检验项目的样品用随机抽取法从外观质量合格的样品中抽取。8.3.3 抽样数量按
7、表 6 进行。98.4 判定规则8.4.1 尺寸偏差应符合表 1 的规定，否则，判不合格。8.4.2 外观质量采用二次抽样方案。首先抽取第一样本（n 1 = 50） ，根据表 2 规定的质量指标，检查出其中不合格品数 d1，按下列规则判定：d1 5 时，外观质量合格；DB21/T 18362010d1 9 时，外观质量不合格；dl5 且 d19 时，需对第二样本（n 2= 50）进行检验，检查出不合格品数 d2，按下列规则判定:（d 1+d2）12 时，外观质量合格（d l+d2）13 时，外观质量不合格。表 6 抽样数量序 号 检验项目 实心砖抽样数量/块 多孔砖抽样数量/块1 外观质量 1
8、00（n 1 = n2 = 50） 100（n 1 = n2 = 50）2 尺寸偏差 20 203 强度等级 15 104 吸水率 3 35 干燥收缩率 3 36 抗冻性 10 107 碳化系数 12 128 软化系数 3 39 放射性 3 38.4.3 各项目检验结果均符合第 6 章各项技术要求的规定时，则判该批产品为相应强度等级合格。8.4.4 原材料与产品中的放射性超过 GB 6566 规定时，应停止生产和销售。9 产品合格证、堆放和运输9.1 蒸压粉煤灰砖出厂时，宜包装，并应提供产品质量合格证、出厂检验报告、干燥收缩曲线和时效范围内型式检验报告。合格证内容包括： a 厂名和商标；b 批
9、量编号和砖的数量（块） ；c 产品标记和检验结果；d 产品质量合格证书编号；e 生产日期；f 检验部门和检验人员签章。9.2 蒸压粉煤灰砖应按规格、等级分批分别堆放，不得混堆。9.3 蒸压粉煤灰砖在堆放、运输时，应采取防雨、水措施；9.4 蒸压粉煤灰砖装卸时，严禁碰撞、扔摔，应轻码轻放，禁止翻斗车倾卸；9.5 蒸压粉煤灰砖应存放 10d 以后出厂。磞磞伤害别人，不被别人伤害”的三不伤害原则。进井场必 须带安全帽，必须穿长裤，必须穿工鞋等等。感觉自己真 向林黛玉在贾府：时时留意，处处小心。 这次钻井方向的实习的目的是使我们了解钻井设备及 工具、钻井工艺流程、钻井技术现状及发展趋势。通过钻 井实习
10、，了解专业工作，增强感性认识，学习基本技能， 深化已学的知识，培养了我们的动手、动脑能力，增强了 我们对石油工程专业的感性认识，了解我国石油工业的现 状，激发我们热爱专业，勤奋学习的热情，培养热爱劳动， 面向实践，注重调查研究的工作作风，为专业课的学习打 下一定的基础。实习期间，我收获了很多钻井工业和管理 的知识，学到了很多，也发现了只学习课本是不够的，理 论必须与实践相结合。同时也真真切切感受到钻井一线工 人艰苦奋斗的精神和认真负责的敬业精神，这些精神深深 感染了我，熏陶了我。通过这次实习，让我对石油工人有 了更加全面的了解，为日后的实际工作打下了基础，同时 使我更加热爱石油工程这个行业，在
11、今后的日子里，我会 更加努力的学习专业知识，为我国的石油事业贡献出自己 的力量！ ICS 65.020.30 B 44 备案号： DB11 北京市 地方标准 DB11/T 828.3 2011 实验用小型猪 第 3部分：遗传质量控制 Experimental minipig Part 3： Genetic quality control 2011 - 11 - 10发布 2012 - 03 - 01实施 北京市质量技术监督局 发布DB11/T 828.3 2011 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 遗传分类及命名 . 1 5
12、繁殖 . 2 6 近交系实验用小型猪的遗传质量监测 . 3 7 封闭群实验用小型猪的遗传质量监测 . 3 附录 A（规范性附录） 近交系实验用小型猪的微卫星 DNA标记检测方法 . 5 附录 B（规范性附录） 封闭群实验用小型猪的微卫星 DNA标记检测方法 . 9 DB11/T 828.3 2011 II 前 言 DB11/T 828的本部分按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 DB11/T 828实验用小型猪分为六个部分： 第 1部分：微生物学等级及监测； 第 2部分：寄生虫学等级及监测； 第 3部分：遗传质量控制； 第 4部分：病理学诊断规范； 第 5部分：配合饲料； 第 6部
13、分：环境及设施。 本部分为 DB11/T 828的第 3部分。 本部分由北京市 科 学 技 术 委员会提 出 并归口 。 本部分由北京市 科 学 技 术 委员会组织 实施。 本部分起草 单位 ： 中国农业科 学 院 北京 畜牧兽医研究所、首都医科大 学 、中国人民解放军军事医 学 科 学 院、吉林大 学。 本部分 主要 起草 人 ： 李奎、陈振 文 、杨述林、吴艳花、冯书堂、杜 小 燕、牟玉莲、董罡、公维华、 任 文 陟、张宁波、徐玲玲 。 DB11/T 828.3 2011 1 实验用小型猪 第 3部分：遗传质量控制 1 范围 DB11/T 828的本部分规定 了 实验用小型猪的遗传分类 、
14、 繁殖方法和近交系及封闭群的遗传质量标 准 。 本部分 适 用 于 实验用小型猪的遗传质量控制。 2 规范性引用文件 下列 文件 对于 本文件的 应 用 是必不可少 的。 凡是注日期 的引用文件 ，仅所注日期 的 版 本 适 用 于 本文 件。 凡是不注日期 的引用文件 ，其最新版 本（ 包括所有 的 修改单 ） 适 用 于 本文件。 GB 14923 实验 动 物 哺乳 类 动 物的遗传质量控制 3 术语和定义 下列 术语和定义 适 用 于 本文件。 3.1 实验用小型猪 experimental minipig 经 人 工 饲 育 ，对其 携带 的病 原 微生物和寄生虫实 行 控制 ， 遗
15、传 背景明确或者来源清楚 ， 12 月龄体 重 不 超过 35kg， 用 于科 学 研究、 教 学 、 生 产 和检定 以 及 其 他 科 学实验的小型猪。 3.2 近交系 inbred strain 经至 少 连续 20代 的 全同胞兄妹 交配 培育而成 ， 品 系 内 所有 个 体 都可 追溯到 起 源 于 第 20代或以后代 数 的 一 对 共同祖先 。 经连续 20代以上亲代与子代 交配和 全同胞兄妹 交配 有 等 同效果 。 近交系的近交系 数 （ inbreeding coefficient） 应大于 99%。 3.3 封闭群（远交群） closed colony （ outbre
16、d stock） 以非 近 亲 交配方 式进行 繁殖生 产 的实验用小型猪 种 群 ， 在 不 从外 部引 入 新 个 体 的 条 件 下， 至 少 连续 繁殖 4代以上 。 4 遗传分类及命名 DB11/T 828.3 2011 2 4.1 遗传分类 根据 遗传 特点 的 不 同 ， 实验用小型猪分为近交系和封闭群。 4.2 命名 4.2.1 近交系命名 近交系 一般以 大 写英 文 字母 命名 ， 亦 可 以 用 大 写英 文 字母加阿拉伯数字 命名 ， 符号 应 尽 量 简短 。 如 WZSP等。 4.2.2 近交代数 近交系的近交 代数 用 大 写英 文 字母 F表示 。 例如当一 个
17、近交系的近交 代数 为 30代时 ， 写成 （ F30）。 4.2.3 其它近交系 亚 系 ， 重 组 近交系 ， 同源突变 近交系 ， 同源 导 入 近交系的定义和命名按照 GB 14923执 行 。 4.2.4 封闭群命名 封闭群的命名按照 GB 14923执 行 。 5 繁殖 5.1 近交系的繁殖 5.1.1 原则 选择 近交系实验用小型猪繁殖方法的 原 则 是 保持 近交系小型猪的 同 基因 性及 基因纯 合性。 5.1.2 引种 作 为繁殖用 种子 的近交系实验用小型猪 ，应 来 自 于 近交系的 基础 群 或 血缘扩 大 群 ， 遗传 背景明确 ， 有 完整 的 资 料（ 包括 品
18、 系名 称 、 近交 代数 、 遗传 基因 特点 及 主要 生物学 特 征 等）。 5.1.3 方法 可 分为 基础 群（ foundation stock） 、 血缘扩 大 群（ pedigree expansion stock）和生 产 群（ production stock）。 当 近交系小型猪生 产 供 应 数 量 不是 很 大 时 ， 一般 不 设 血缘扩 大 群 ，仅 设 基础 群和生 产 群。 基 础 群 、 血缘扩 大 群和生 产 群的 具 体 繁殖方 式 按照 GB 14923执 行 。 5.2 封闭群的繁殖 5.2.1 原则 选择 封闭群实验用小型猪繁殖方法的 原 则 是
19、保持 封闭群小型猪的遗传 异 质性及 基因多态 性 ， 避免 近交系 数 随 繁殖 代数 增 加而过 快 上 升 。 5.2.2 引种 5.2.2.1 作 为繁殖用 种子 的封闭群小型猪 应 遗传 背景明确或来源清楚 ，有 完整 的 资 料（ 包括 种 群名 称 、 来源 、 遗传 基因 特点 及 主要 生物学 特 性等）。 DB11/T 828.3 2011 3 5.2.2.2 根据 繁殖方 式 ， 在 保证每 代 近交系 数 增 量 不大于 1%的前 提下， 决 定 最 小引 种 规 模 。 如 采 用 循 环交配方 式 ， 引 种数 量 不 得 少于 13对 无血缘关 系（ 三 代以内
20、无 共同祖先 ）的 公 母 猪； 若采 用 随机 交配 方 式 ， 引 种数 量 不 得 少于 25对 无血缘关 系的 公 母 猪。 5.2.3 方法 封闭群 应 足够 大， 以 保持 封闭群实验用小型猪的遗传 基因 的 稳 定 ，并 尽 量 避免 近 亲 交配。 具 体 繁 殖方法按照 GB 14923执 行 。 6 近交系实验用小型猪的遗传质量监测 6.1 检测方法 采 用微卫星 DNA标记检测方法。 具 体 方法 执 行 附录 A。 6.2 抽样 对 基础 群 ，凡 在子代 留 有 种 猪的 双 亲动 物 都应 进行 检测。 对 生 产 群 ， 按 表 1要 求 从 每 个近交系 中 随
21、机抽取 非同 窝 成 年 猪 ，公 母 各半 。 表 1 近交系实验用小型猪遗传检测抽样要求 生 产 群 中 种母 猪 数 量 抽样 数 量 少于 100头 6头 大于 100头 不少于 6% 6.3 结果判定 近交系实验用小型猪遗传检测 结 果 的 判 定按 表 2执 行 。 表 2 近交系实验用小型猪遗传检测结果判定 检测 结 果 判 定 与 标 准 遗传 概貌完 全一 致 未发现 遗传 变 异 有 一 个 位 点 的标记 基因 与 标 准 遗传 概貌 不 一 致 遗传 发 生 变 异 6.4 判定结论 所有 样 品 检测 位 点 的等 位 基因 都 符 合 品 系的 特 征 ， 没 有新
22、 的等 位 基因 出 现 为合 格 实验用小型猪近交 系 ， 否 则 判 为 不 合 格 。 6.5 检测时间间隔 近交系实验用小型猪生 产 群 每年 至 少 进行一 次 遗传质量检测。 7 封闭群实验用小型猪的遗传质量监测 7.1 检测方法 DB11/T 828.3 2011 4 采 用微卫星 DNA标记检测方法。 具 体 方法 执 行 附录 B。 7.2 抽样 按 表 3要 求 从 每 个封闭群 中 随机抽取 非同 窝 成 年 猪 ，公 母 各半 。 表 3 封闭群实验用小型猪遗传检测抽样要求 群 体数 量 抽样 数 量 少于 100头 不少于 15头 大于 100头 不少于 30头 7.
23、3 结果判定 群 体内 遗传 变 异采 用 平均杂 合 度指 标 或 群 体 平衡状态 方法 进行 评价 。 当 平均杂 合 度 在 0.5 0.7时 ， 且 期 望杂 合 度 与 观 测 杂 合 度 经 卡 方检验 无 明 显差异 时 ， 群 体 为合 格 的 封闭群实验用小型猪群 体 。 或 用群 体 是 否达 到 平衡状态 来 判 定 ， 如果 没 有 达 到 平衡状态 ， 说 明 群 体 的 基 因频率 或 基因 型 频率发 生 变 化 ， 该 封闭群实验用小型猪群 体 判 为 不 合 格 。 具 体 方法 执 行 附录 B。 7.4 检测时间间隔 封闭群实验用小型猪生 产 群 每两年
24、 至 少 进行一 次 遗传质量检测。 DB11/T 828.3 2011 5 A A 附 录 A （规范性附录） 近交系实验用小型猪的微卫星 DNA标记检测方法 A.1 微卫星分子标记检测的原理 采集 近交系实验用小型猪的 血液 或 耳 组织，提 取基因 组 DNA。 对 特 定的微卫星标记 座 位 进行 PCR 扩增 ， 通 过 遗传分 析仪 检测 各 座 位 基因 的 峰形 和 大 小 ， 确 定 各 近交系的微卫星标记的遗传 概貌 。 A.2 仪器设 备 A.2.1 常压电泳仪 。 A.2.2 4 、 20冰箱 。 A.2.3 低温高速离心 机 。 A.2.4 水浴锅 。 A.2.5 感
25、 量为 0.0001g的分 析天 平 。 A.2.6 pH计 。 A.2.7 紫 外 分 光光 度 仪 。 A.2.8 PCR仪 。 A.2.9 遗传分 析仪 。 A.3 微卫星 DNA标记检测方法 A.3.1 样 本 的 采集 A.3.1.1 耳 静脉 或 前 腔静脉 采血 2ml， 加 等量的 血液 裂 解 液 。 A.3.1.2 采集 大 小 0.5g的 耳 组织 样 ，放 入 75%乙醇 保 存 。 A.3.2 基因组 DNA的 提取 用 苯酚氯仿 法 或 试剂盒 提 取基因 组 DNA。 A.3.3 微卫星标记 位点 用 10个分 布 于 猪 单 倍 体 10条 主要 染色 体上 的
26、微卫星 位 点 检测近交系小型猪的遗传 概貌 。 各 微卫星 位 点 的 染色 体 位 置 、 等 位 基因 数 、 引物 序 列 及 荧光 标记 ， PCR反 应 的 Tm值 、 镁离 子 浓 度 见 表 A.1。 A.3.4 PCR扩增 A.3.4.1 PCR扩增 的 体 系 PCR总反 应 体 积 为 15 l,其中 含 1 PCR buffer,200 M dNTPs,各 400pM的 上 下 游 引物 ， MgCl2（ 浓 度 见 表 A.1） ， 0.1 l (5U/ l)的 TaqTM,100ng的 基因 组 DNA。 PCR反 应 程序 为 94 C, 4min； 94 C，
27、30s； 退火 ， 30s； 72 C,30s,30个 循 环 ， 72 C延伸 7min。 A.3.4.2 PCR产物 的检测 DB11/T 828.3 2011 6 PCR产 物 ， 以 2 的 琼脂糖 检测 扩增 效 率 。 凝胶 成 像 系 统 记录检测 结 果 。 A.3.5 个体基因 型的判定 A.3.5.1 PCR产物 的 变 性 根据 琼脂糖 检测的 结 果 ，对 PCR产 物 进行 稀释 。 若 2%的 琼脂糖 检测的 条带 亮 度基 本 相 同 ， 即 PCR的 扩 增 效 率基 本 相 同 ， 则 FAM、 HEX、 TAMRA三 种 标记的 三 个 位 点 的 PCR产
28、 物分 别 取 1ul混 合 ， 加到 每 孔含 8.5ul 的 甲酰胺 和 内 标的 96孔板 上 （ 860ul甲酰胺 加 10ul内 标 ， 混匀 ， 分 装 到 96孔板 上 ） ， 95 C变 性 5分 钟 ， 迅 速 放 在 冰 上 。 待 96孔板降温 后 ， 用 铝箔纸 包 好 ， 4 保 存 备 用。 A.3.5.2 基因 型的判定 含 变 性 后 的 PCR产 物的 96孔板 放 入 遗传分 析仪 内进行 分 析 ， 原 始 峰 图 用 基因 分型 软 件 进行 分 析 ， 确 定 特 定 位 点 各 个 体 的 峰形 和 大 小 ， 判 定个 体 的 基因 型。 A.3.
29、6 结果判定 所有 样 品 检测 位 点 的等 位 基因 都 符 合 品 系的 特 征 (见 表 A.2)， 没 有新 的等 位 基因 出 现 为合 格 实验用 小型猪近交系 ,否 则 判 为 不 合 格 。 A.4 结果 报告 根据 判 定 结 果 对 被 检测的实验用小型猪群 体 做 出检测 报告 。 DB11/T 828.3 2011 7 表 A.1 各 微卫星 座位 的 染色体位置、等位基因 数 、等位基因片段 范围 、荧光 标记 、两侧 引 物序列 （ 左侧 ： F，右侧 ： R） 、退火温度 和 镁离 子 浓度 座 位 名 称 染色 体 位 置 等 位 基 因 数 等 位 基因 范
30、围 bp 5荧光 标记 引物 序 列 5 3 Tm Mg2+ (mM) CGA 1q 12 250-320 FAM F-ATA GAC ATT ATG TAA GTT GCT GAT R-GAA CTT TCA CAT CCC TAA GGT CGT 55 2.5 SW240 2P 8 96-115 TAMRA F-AGA AAT TAG TGC CTC AAA TTG G R-AAA CCA TTA AGT CCC TAG CAA A 55 1.5 SW72 3P 8 100-116 TAMRA F-ATC AGA ACA GTG CGC CGT R-GTT TGA AAA TGG GGT
31、GTT TCC 55 1.5 S0005 5q 10 205-248 FAM F-TCC TTC CCT CCT GGT AAC TA R-GCA CTT CCT GAT TCT GGG TA 55 3.0 S0090 12q 4 244-251 TAMRA F-CCA AGA CTG CCT TGT AGG TGA ATA R-GCT ATC AAG TAT TGT ACC ATT AGG 55 1.5 SW769 13 7 106-140 HEX F-GGT ATG ACC AAA AGT CCT GGG R-TCT GCT ATG TGG GAA GAA TGC 55 3.0 SW857
32、 14 6 144-160 TAMRA F-TGA GAG GTC AGT TAC AGA AGA CC R-GAT CCT CCT CCA AAT CCC AT 55 1.5 S0355 15 14 243-277 HEX F-TCT GGC TCC TAC ACT CCT TCT TGA TG R-GTT TGG GTG GGT GCT GAA AAA TAG GA 55 3.0 SW24 17 8 96-121 FAM F-CTT TGG GTG GAG TGT GTG C R-ATC CAA ATG CTG CAA GCG 55 1.5 S0218 X 8 164-184 TAMRA
33、F-GTG TAG GCT GGC GGT TGT R-CCC TGA ACC CTA AAG CAA AG 55 1.5 DB11/T 828.3 2011 8 表 A.2 五指山 小型猪近交系 、广西巴马 小型猪和 贵州 小型猪近交系 培育过程中， 遗传质量控制的微卫星 座位 及 优势等位基因 等 位 基因 座 位 等 位 基因 座 位 等 位 基因 座 位 等 位 基因 座 位 等 位 基因 座 位 等 位 基因 座 位 等 位 基因 座 位 等 位 基因 座 位 等 位 基因 座 位 等 位 基因 座 位 群 体 CGA SW769 SW857 S0005 SW240 S0355 SW
34、72 S0090 S0218 SW24 五 指 山 小型猪近交系 189 0.023 105 0.093 150 0.163 238 0.671 116 0.171 258 0.750 106 0.588 241 0.756 173 0.012 104 0.631 199 0.872 129 0.907 158 0.837 124 0.537 266 0.138 114 0.238 247 0.012 179 0.547 203 0.023 181 0.419 293 0.081 等 位 基因频率 合 计 1.000 0.907 1.000 0.671 0.707 0.888 0.825 0.
35、756 0.547 0.631 广西巴马 小型猪 271 0.490 123 0.194 146 0.146 216 0.223 94 0.531 258 0.083 110 0.698 241 0.032 167 0.115 102 0.750 277 0.281 127 0.806 154 0.573 226 0.660 98 0.333 260 0.427 120 0.083 243 0.117 173 0.740 104 0.021 297 0.229 104 0.115 262 0.427 247 0.489 179 0.125 249 0.117 187 0.021 等 位 基因频
36、率 合 计 1.000 1.000 0.719 0.883 0.979 0.854 0.781 0.606 0.854 0.750 贵州 小型猪 271 0.011 105 0.291 156 0.167 202 0.558 96 0.227 252 0.183 102 0.170 247 0.045 181 0.151 100 0.114 283 0.136 121 0.267 160 0.452 204 0.244 102 0.182 254 0.098 249 0.580 187 0.186 104 0.114 285 0.364 129 0.093 166 0.202 214 0.18
37、6 272 0.110 112 0.625 253 0.375 195 0.023 108 0.216 305 0.295 133 0.151 274 0.341 118 0.045 197 0.500 112 0.136 139 0.081 145 0.116 等 位 基因频率 合 计 0.795 0.907 0.821 0.988 0.409 0.732 0.841 0.955 0.709 0.466 DB11/T 828.3 2011 9 附 录 B （规范性附录） 封闭群实验用小型猪的微卫星 DNA标记检测方法 B.1 基因组 DNA的 提取 用 苯酚氯仿 法 或 试剂盒 提 取基因
38、组 DNA。 B.2 微卫星 位点 用 25个分 布 于 猪 17条 常染色 体 和 X性 染色 体上 的微卫星 位 点 检测封闭群小型猪的遗传 概貌 。 各 微 卫星 位 点 的名 称 、 引物 序 列、 在 染色 体 位 置 、 等 位 基因 数 、 PCR反 应 的 Tm值 、 镁离 子 浓 度 及等 位 基因 分 布 范围 见 表 B。 B.3 PCR扩增 B.3.1 PCR扩增 的 体 系 PCR总反 应 体 积 为 15 l,其中 含 10 PCR buffer:1.5 l， 上 下 游 引物 (100 pmol/ L) 各 1 L ,4 dNTP 100 mol/L :1 L ,
39、Taq 酶 1U:1 L ,50 ng 100 ng 基因 组 DNA:1 L ,纯 水 (ddH2O) :8.5 L 。 PCR反 应 程序 为： 95 预 变 性 , 4min； 94 变 性 ， 30s； 退火温 度 （ 各 位 点 退火温 度 参 见 表 B） ， 30s； 72延伸 ， 30s； 35个 循 环； 72 继 续 延伸 7min； 扩增 产 物 4 保 存 。 B.3.2 PCR产物 的检测 PCR产 物 ， 经 1.5 的 琼脂糖凝胶电泳 以 及 凝胶 成 像 系 统 拍 照检测 扩增结 果 。 B.3.3 扩增产物 的 STR扫描 扩增 产 物 经过 琼脂糖凝胶电泳
40、 检测 确 保扩增 出 目 的 片 断 后 ， 选择 分 别 以 FAM、 HEX、 TAMRA标记的 三 个 位 点 的 扩增 产 物 ， 以 1： 3： 5体 积 比 混 合 ， 取 1 l上 样 进行 STR扫描 。 B.4 STR扫描 结果的判 读与统计 分 析 B.4.1 STR扫描 结果的判 读 扫描 结 果 出 现两 种 波 形 ： 一种 为 纯 合 基因 型 ， 只 有 一 个 主波 ； 另 一种 为 杂 合 基因 型 ，有 两 个 主波 。 同时 ， 根据 软 件 读 出 波 峰 处 的 扩增 产 物的 bp数 。 由 基因 分型 软 件 读 出 每 个 样 本 在 每 个微
41、卫星 位 点 的 扩增 片 断 大 小。 每 个 位 点 的等 位 基因 根据 扩增 片 断 从 小 到 大 顺 序 排 列 纪 录为 a,b,c,d等。 B.4.2 运 用群 体 遗传分 析软 件 对 数 据进行统计 分 析 将 所有 样 本的 每 个微卫星 位 点 的 基因 型 以 ab,bb等 形 式 输 入 群 体 遗传分 析 软 件的 数据 文件 ， 计 算 样 品在 各 微卫星 位 点上 的 基因频率 、 平均观 察 等 位 基因 数 、 平均 有 效 等 位 基因 数 （ Ne） 、 相 隆 指 数 、 平均 杂 合 度 （ H）等。 B.5 结果判定 平均杂 合 度 在 0.5
42、 0.7时 ， 且 期 望杂 合 度 与 观 测 杂 合 度 经 卡 方检验 无 明 显差异 时 ， 群 体 为合 格 的 封闭群实验用小型猪群 体 。 或者 ，首 先 得 到 各 个 位 点上 各基因频率 、 基因 型 频率 的实 际 值 ， 然 后 可 计 算 出 基因频率 和 基因 型 频率 的 预 期 值 。用实 际 值 和 预 期 值 比较 ， 通 过 卡 方检验 ，可 知被 监测群 体 是 否达 到DB11/T 828.3 2011 10 平衡状态 。 如果 没 有 达 到 平衡状态 ， 说 明 群 体 的 基因频率 或 基因 型 频率发 生 变 化 ， 该 封闭群实验用小型 猪群 体 判 为 不 合 格 。 B.6 结果 报告 根据 判 定 结 果 对 被 检测的封闭群实验用小型猪群 体 做 出检测 报告 。 DB11/T 828.3 2011 11 表 B 各 微卫星 座位 的引 物序列、染色体位置、最佳扩增条 件 、等位基因 数及 等位基因 分布范围 位 点 引物 序 列 (5 -3 ) 所 在 染 色 体 镁离 子 浓 (mmol/L) 退火温 度 ( ) 等 位 基 因 数 等 位 基因 范围 SW974 GGTGAAGTTTTTGCTTTGAACC GAAAGAAATCCAAATCCAAACC 1 2.0 58 17 129-175 S0091 TC
