1、 福建森宝食品集团股份有限公司企业标准 Q/JCWI 02182013 饲料中黄曲霉毒素饲料中黄曲霉毒素 B1B1 残留检测残留检测 酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法 2013 - 08 - 01 发布 2013 - 08 - 01 实施 福建森宝食品集团股份有限公司 发 布 Q/JCWI 02182013 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草 本标准由公司检测中心提出并审核 本标准起草单位：检测中心 本标准起草人：张超红 本标准批准人：黄金兰 本标准于2013年8月1日首次发布。 Q/JCWI 02182013 II 修改履历表修改履历表
2、 版本版本 章节章节 条款条款 修改内容或记录号修改内容或记录号 修改人修改人 （起草人）（起草人） 批准人批准人 修改日期修改日期 （发布日期）（发布日期） 实施日期实施日期 A/0 全新发布 张超红 黄金兰 2013.8.1 2013.8.1 Q/JCWI 02182013 1 饲料饲料中中黄曲霉毒素黄曲霉毒素 B1B1 残留检残留检酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了饲料中黄曲霉毒素B1残留量，酶联免疫检测方法的制样和检测方法。 本标准适用于饲料中黄曲霉毒素B1残留量的测定。 2 试验原理 本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的黄
3、曲霉毒素和酶标板微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗黄曲霉毒素的抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含残留物黄曲霉毒素B1的含量成负相关， 与标准曲线比较， 再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中黄曲霉毒素B1残留量。 3 交叉反应率 黄曲霉毒素 B1100% 黄曲霉毒素B294% 黄曲霉毒素G177% 黄曲霉毒素G233% 4 设备及试剂 以下所用材料，除特别注明者外，均为分析纯；水为符合以下所用材料，除特别注明者外，均为分析纯；水为符合GB/T 6682GB/T 6682规定的二级水。规定的二级水。 4.1 设备 微孔板酶标仪450/630nm 振荡器 涡旋仪 天平：感量0.
4、01g 刻度移液管：10ml 洗耳球 聚苯乙烯离心管：50ml、2ml 微量移液器：单道 20200l、1001000l 多道250l 4.2 试剂 甲醇(分析纯) 氯化钠(分析纯) 去离子水 Q/JCWI 02182013 2 5 试剂盒提供的材料与试剂 5.1 96 孔酶标板 1 块 （包被有偶联抗原） 5.2 标准品 6 瓶：（1ml/瓶） 0ppb, 0.3ppb, 0.6ppb,1.2ppb,3.6ppb, 10.8ppb 5.3 酶标二抗 7ml 5.4 抗体工作液 10ml 5.5 底物液 A 液 7ml 5.6 底物液 B 液 7ml 5.7 终 止 液 7ml 5.8 20
5、浓缩洗涤液 40ml 6 溶液的配制 6.1 配液 1: 70%甲醇溶液 用去离子水将甲醇(分析纯)按7:3体积比进行稀释 （7份甲醇+3份去离子水） 用于样本前处理。 6.2 配液 2: 洗涤工作液 用去离子水将20浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释（1份20浓缩洗涤液+19份去离子水）用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4（39.2）环境可保存一个月。 7 样本前处理步骤 7.1 处理任何样本时，都必须注意： 处理任何样本时，都必须注意： a) 实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。 b) 实验之前须检查各种实验器具是否洁净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。 c)
6、 移取离心后的上清液时，需将离心管稍微倾斜移取，避免取到杂质。 饲料（原料、配合料和饲料（原料、配合料和浓缩料）样本前处理方法浓缩料）样本前处理方法 称取2.0 0.05g饲料样本于50ml聚苯乙烯离心管中，加入0.5g 氯化钠，再加入10ml 70%甲醇（见配液1），用振荡器强烈振荡5min，在3000g以上，室温（20-25/68-77）离心5min； 移取500l上清液加入500l去离子水，用振荡器振荡混匀； 取20l用于分析。 8 检测步骤 8.1 测定前应须知： Q/JCWI 02182013 3 8.1.1 使用之前将模具内所有试剂与酶标板放实验桌回温至室温（20-25/68 -7
7、7）。 8.1.2 使用之后立即将所有试剂放回 2-8（36-46）。 8.1.3 在 ELISA 分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是 ELISA 测定程序中的要点。 8.1.4 在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。 9 操作步骤： 9.1 将所需试剂从冷藏环境中取出，按照上述方法进行回温，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。 9.2 取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放回铝箔袋重新真空密封，保存于 2-8（36-46）环境中。 9.3 浓缩洗涤液在使用前也需按上述方法回温。 9.4 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做 2 孔
8、平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。 9.5 加标准品/样本、酶标二抗和抗体工作液：加入标准品/样本 20l 到对应的微孔中，然后加入酶标二抗 50l/孔，再加入抗体工作液 80l/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置 25(77)避光环境中反应 20min。 9.6 洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液（见配液 2）250l/孔，充分洗涤 45 次，每次间隔 10s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。 9.7 显色：加入底物液 A 液 50l/孔，再加入底物液 B 液 50l/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后，置 25(77)避光环境中反应 10mi
9、n（见注意事项 8）。 9.8 测定：加入终止液 50l/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于 450nm 处（建议用双波长 450/630nm检测，在 5min 内读完数据），测定每孔 OD 值。(若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定) 10 结果判定 结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光度值与其所含黄曲霉毒素B1的含量成负相关。 10.1 用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本 1 的吸光度值为1.749，样本 2 的吸光度值为 0.613，标准品吸光度值分别是：0ppb 为 1.969；0.3ppb 为 1.763
10、；0.6ppb为 1.426； 1.2ppb 为 0.919； 3.6ppb 为 0.308； 10.8ppb 为 0.124。 则样本 1 的浓度范围是 0.3ppb-0.6ppb再再乘以其对应的稀释倍数乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中黄曲霉毒素即可得出样本中黄曲霉毒素 B1B1 残留的浓度范围；残留的浓度范围；样本 2 的浓度范围是1.2ppb-3.6ppb 再再乘以其对应的稀释倍数乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中黄曲霉毒素即可得出样本中黄曲霉毒素 B1B1 残留的浓度范围。残留的浓度范围。 10.2 定量分析 10.2.1 百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的
11、平均吸光度值（双孔）除以第一个标准品（0 标准）的平均吸光度值,再乘以 100%，即 Q/JCWI 02182013 4 B 百分吸光度值（%）= B标准品或样本溶液的平均吸光度值 B00ppb标准溶液的平均吸光度值 10.2.2 标准曲线的绘制与计算 以标准品百分吸光率为纵坐标，以黄曲霉毒素B1标准品浓度（ppb）的对数为横坐标,绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍乘以其对应的稀释倍数即数即为样本中为样本中黄曲霉毒素黄曲霉毒素B1B1的的实际浓度。实际浓度。 样本稀释倍数样本稀释倍数 饲料样本稀释倍数：饲料样本稀释倍数：101
12、0倍倍 11 检测方法灵敏度、准确度、精密度 试剂盒灵敏度：0.3ppb 样本最低检测限： 饲料3ppb 准确度： 饲料90% 20% 精密度： 试剂盒的板内、板间变异系数均小于10%。 12 注意事项 1、室温低于20（68）或试剂及样本的温度没有回到室温（20-25/68-77）会导致所有标准的OD值偏低。 2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。 3、每加一种试剂前需要将其摇匀。 4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。 5、不要使用超出有效期的试剂盒；也不要使用超出有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用超出有
13、效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。 6、储存条件 保存试剂盒于2-8（36-46），不要冷冻，将不用的微孔板放回铝箔袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。 7、试剂变质的迹象 发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm0.5）时，表示试剂可能变质。 8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色10min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到15min,但一般不得超过20min。反之，则减短反应时间。 13 贮藏条件及保存期 B0 Q/JCWI 02182013 5 贮藏条件：保存试剂盒于2-8(36-46)环境中。 保存期：该产品有效期为12个月。 _
