1、非洲猪瘟诊断技术研究与应用遇秀玲洛阳普泰生物技术有限公司国家兽用药品工程技术研究中心目 录CONTENTS当前非洲猪瘟的诊断要点一二非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测技术的研究与应用三非洲猪瘟病毒荧光热对流PCR的研究与应用一、当前非洲猪瘟的诊断要点一、当前非洲猪瘟的诊断要点未发病猪场可疑/发病猪场已清场猪场如何保证持续平稳生产？如何快速诊断并定点清除？如何成功实现复养？准确、快速的诊断检测至关重要二、二、非洲猪瘟病毒荧光热对流PCR的研究与应用p 灵敏度高，特异性好：可实现准确诊断p 实验条件要求高、操作复杂、耗时长：难以实现现场快速诊断p 易污染：难以清除核酸污染核酸诊断的特点如何实现核酸诊断
2、的准、快、便、净变性延伸退火58609496温度梯度荧光定量PCR荧光热对流PCR热循环模块通过升温降温产生温度梯度温差密度差对流，形成持续的温度梯度荧光检测模块qPCR仪cPCR扩增仪一体化计算分析模块电脑1、荧光热对流PCR的反应原理2 2、荧光热对流、荧光热对流PCRPCR的核心技术的核心技术更快！更快、更准、更方便！p 引物探针：特殊修饰p DNA聚合酶：特殊改造，高效扩增p 缓冲液：抗干扰，免提核酸更快、更净！传统PCR热对流PCR低温高温高温变性低温退火适温延伸单一加热模块双恒温模块p 变性、退火、延伸三步合一p 充分对流，一次性密封专利管型直接取样cPCR配液扩增检测、结果判定检
3、测时间70min核酸提取扩增检测取样PCR配液传统PCR热对流PCR30min3 3、荧光热对流、荧光热对流PCRPCR的操作流程的操作流程40min检测时间20-30min结果判定品数普通光PCR（qPCR）荧光热对流PCR（cPCR）等温增第一批11801第二批342716第二批4 4、农业农村部非洲猪瘟诊断试剂评价结果洛阳普泰生物技术有限公司非洲猪瘟病毒荧光热对流PCR（cPCR）快速检测试剂盒5 5、ASFV荧光热对流PCR与qPCR的灵敏度比较产品名称样品稀释度10-50.7510-50.510-50.2510-510-6国产1-qPCR+-国产2-qPCR+-国产3-qPCR+-国
4、产4-qPCR+-国产5-qPCR+-进口1-qPCR+-进口2-qPCR+-洛阳普泰-cPCR+-6 6、ASFV荧光热对流PCR的临床应用地 点样品类型特异性敏感性猪场1口腔、全血拭子12/126/6猪场2血浆12/126/6血清10/102/2饲料2/24/4猪场3血清18/186/6唾液6/66/6组织18/1810/10饲料5/57/7屠宰场血清18/186/6肌肉18/182/2荧光热对流PCR适用于各种临床样品的检测非洲猪瘟病毒荧光热对流PCR（cPCR）快速检测试剂盒（用于检测猪血清、全血、组织、拭子等样本中的非洲猪瘟病毒（ASFV）核酸）便携式cPCR扩增仪便携式cPCR移动
5、检测实验室7 7、ASFV荧光热对流PCR仪和配套试剂准：敏感性、特异性和荧光定量PCR相当快：免核酸提取、扩增时间短（20min）便：仪器小型便携、操作简单、自动显示结果、非专业人员可现场操作净：无提取过程，减少核酸污染；特制cPCR管全程封闭，避免核酸污染ASFV荧光热对流PCR快速检测试剂盒二、二、非洲猪瘟病毒荧光热对流PCR的研究与应用pASFV抗体的监测ASFV感染史ASFV疫苗抗原检测是否可以满足现有临床的所有需求？p 结构复杂，编码160多种病毒蛋白p ASFV是一个十分巨大、复杂的病原体三、非洲猪瘟病毒三、非洲猪瘟病毒ELISAELISA抗体检测技术的研究及应用抗体检测技术的研
6、究及应用糖基化修饰蛋白：CD2v、A238L含跨膜区蛋白：p54、EP153R多聚蛋白：p62、p220不需后续修饰的蛋白：p72、p30蛋白酶、核酸酶：S273、D250RCHO表达系统杆状病毒表达系统大肠杆菌表达系统根据不同蛋白是否需要糖基化修饰、是否含有跨膜区、是否有细胞毒性等特性，选择不同的表达系统1、核心抗原的研究-ASFV相关蛋白的表达与纯化三、非洲猪瘟病毒三、非洲猪瘟病毒ELISAELISA抗体检测技术的研究及应用抗体检测技术的研究及应用1、核心抗原的研究-ASFV相关蛋白的表达与纯化三、非洲猪瘟病毒三、非洲猪瘟病毒ELISAELISA抗体检测技术的研究及应用抗体检测技术的研究及
7、应用蛋白分构蛋白病毒组装相关蛋白免疫逃避相关蛋白毒力相关蛋白复制相关酶蛋白MGF360其它蛋白数量2341631665p 3种表达系统p 7类73种蛋白截止2019年12月27日展段小鼠免疫ELISA胞定腹水制抗化胶体金纸条调试蛋白数量443025161010p 已获得针对25种蛋白的417株杂交瘤细胞p 针对10种蛋白的216株单抗进行了纯化和纸条调试McAb纯化的蛋白诊断试剂1、核心抗原的研究-ASFV相关蛋白的表达与纯化三、非洲猪瘟病毒三、非洲猪瘟病毒ELISAELISA抗体检测技术的研究及应用抗体检测技术的研究及应用截止2019年12月27日2、抗体检测试剂盒的研发样品盘的建立特异性样
8、品盘p 2016-2017年临床血清p 亚单位疫苗免疫血清p 其它常见病原阳性血清p 基因缺失猪感染猪血清p 野毒感染存活猪血清敏感性样品盘三、非洲猪瘟病毒三、非洲猪瘟病毒ELISAELISA抗体检测技术的研究及应用抗体检测技术的研究及应用特异性53%-79%抗原优选特异性大于95%特异性大于99%样品稀释液酶标稀释液2、抗体检测试剂盒的研发-抗原筛选与工艺优化三、非洲猪瘟病毒三、非洲猪瘟病毒ELISAELISA抗体检测技术的研究及应用抗体检测技术的研究及应用不同蛋白建立间接ELISA方法多抗原组合敏感性大于95%CV值小于10%固相载体活化抗原重置系统稳定性批内重复性好批间重复性好 盒果口1
9、口2口3普泰阴性128154165180阳性5226150特异性71.11%85.56%91.67%100%样品背景其它常见病原阳性血清亚单位疫苗免疫血清2017年临床血清2016年临床血清数量（份）404050502、抗体检测试剂盒的研发-特异性研究180份特异性血清样品信息三、非洲猪瘟病毒三、非洲猪瘟病毒ELISAELISA抗体检测技术的研究及应用抗体检测技术的研究及应用p 人工感染猪：感染后10-14日开始抗体转阳Cut-off值Cut-off值2、抗体检测试剂盒的研发-敏感性研究三、非洲猪瘟病毒三、非洲猪瘟病毒ELISAELISA抗体检测技术的研究及应用抗体检测技术的研究及应用3、AS
10、FVELISA抗体检测试剂盒的第三方评价结果阴性猪群血清品S/P果品S/P果品S/P果1-0.007 阴性21-0.006 阴性360.147 阴性2-0.006 阴性220.005 阴性370.283 阴性30.000 阴性23-0.004 阴性380.034 阴性4-0.005 阴性24-0.004 阴性390.091 阴性5-0.012 阴性25-0.008 阴性400.056 阴性6-0.008 阴性26-0.004 阴性410.030 阴性7-0.001 阴性270.015 阴性420.018 阴性8-0.005 阴性28-0.006 阴性430.025 阴性9-0.005 阴性29
11、-0.008 阴性44-0.002 阴性100.000 阴性300.004 阴性450.074 阴性11-0.001 阴性31-0.007 阴性12-0.008 阴性320.013 阴性13-0.007 阴性330.005 阴性14-0.004 阴性34-0.006 阴性15-0.004 阴性35-0.002 阴性160.002 阴性17-0.004 阴性18-0.004 阴性19-0.002 阴性20-0.006 阴性特异性100%（45/45）三、非洲猪瘟病毒三、非洲猪瘟病毒ELISAELISA抗体检测技术的研究及应用抗体检测技术的研究及应用A阳性血清B19B20S/PCVS/PCV1.7
12、00 2.78%2.756 2.24%1.771 2.820 1.793 2.697 1.131 6.40%2.113 4.51%1.074 2.180 0.995 2.309 0.552 6.24%1.715 1.84%0.546 1.747 0.610 1.780 B阳性血清A5A11A14S/PCVS/PCVS/PCV2.970 4.49%3.053 2.50%2.417 2.35%2.787 3.024 2.321 2.726 2.911 2.321 2.199 5.76%2.723 1.57%1.709 7.70%2.386 2.795 1.787 2.463 2.802 1.982
13、 1.852 5.62%2.295 1.86%1.172 1.68%2.067 2.380 1.135 2.009 2.323 1.166 敏感性好，重复性好3、ASFVELISA抗体检测试剂盒的第三方评价结果三、非洲猪瘟病毒三、非洲猪瘟病毒ELISAELISA抗体检测技术的研究及应用抗体检测技术的研究及应用p 阳性血清均可检出p 2倍系列稀释检测结果梯度良好p 重复性检测CV值均小于10%p猪场情况：2019年3月20日开始发病，整群猪均卧地不起，无法单独隔离某个发病圈舍；1头小保育猪发病6-7天左右，1头稍大的保育猪发病10天以上，消瘦，耳朵发紫，眼红，均被处死采样。p检测结果：2019年
14、4月1日送样20份，抗体检测阳性率15%（3/20），PCR检测均为阳性。4、ASFVELISA抗体检测试剂盒的临床应用（一）-感染史追溯三、三、ASFVELISAASFVELISA抗体检测技术的研究及应用抗体检测技术的研究及应用号ELISA抗体 果PCR 果ODS/P果判定1#0.01540.0149-+2#0.24110.2336-+3#0.01290.0125-+4#0.02210.0214-+5#0.55910.5418+6#0.01380.0134-+7#0.25920.2512-+8#0.01450.0141-+10#0.01530.0148-+11#0.01050.0102-+1
15、2#0.01540.0149-+13#1.63101.5804+14#0.01620.0157-+15#0.02130.0206-+16#0.02380.0231-+17#0.01260.0122-+18#0.01330.0129-+小猪血清0.22620.2192-+大猪血清3.39603.2907+号ELISA抗体 果PCR 果ODS/P果判定LY-10.03260.0387-+LY-20.02360.0280-+LY-33.53204.1918+-LY-41.22801.4574+LY-53.70504.3971+-LY-63.51004.1657+-LY-72.12702.5243+-
16、LY-83.01203.5746+-LY-90.46040.5464+LY-100.06840.0812-+LY-110.00850.0101-LY-120.00840.0100-+LY-130.03780.0449-+LY-140.01310.0155-+LY-153.26603.8761+-p猪场情况：2019年1月底开始发病，母猪不食，发烧，呕吐，便秘，部分猪耳朵，腹部发紫，个别有出血斑和皮肤发黄，确诊后母猪全部淘汰，育肥猪大部分淘汰，至2019年2月底，猪场存活下来1000头左右，无明显临床症状，猪场看似平稳。p检测结果：2019年3月初送样15份，抗体和PCR检测阳性率均为53.3%
17、（8/15）4、ASFVELISA抗体检测试剂盒的临床应用（一）-感染史追溯三、三、ASFVELISAASFVELISA抗体检测技术的研究及应用抗体检测技术的研究及应用p猪场情况：2018年12月开始发病，发病猪皮肤发紫，高烧，一般发病2-5天死亡，目前猪场基本平稳，剩余3000头左右。p检测结果：2019年3月20日送样20份，抗体检测阳性率为100%（20/20），PCR检测均为阴性。4、ASFVELISA抗体检测试剂盒的临床应用（一）-感染史追溯三、三、ASFVELISAASFVELISA抗体检测技术的研究及应用抗体检测技术的研究及应用号ELISA抗体 果PCR 果ODS/P果判定13.
18、47604.1253+-23.41704.0553+-33.19303.7895+-43.30703.9248+-53.46304.1099+-63.30203.9188+-73.19503.7918+-83.36303.9912+-93.22703.8298+-103.52904.1882+-113.23703.8417+-123.05503.6257+-133.49104.1431+-143.42704.0672+-153.17303.7657+-163.44004.0826+-173.64204.3223+-183.39504.0292+-193.40004.0351+-203.3700
19、3.9995+-一次野毒感染耐过，抗体水平能达到多高？能持续多久？某猪场同群猪不同时间非洲猪瘟病毒抗体检测结果4、ASFVELISA抗体检测试剂盒的临床应用（二）-抗体持续监测三、三、ASFVELISAASFVELISA抗体检测技术的研究及应用抗体检测技术的研究及应用20190926编号A值S/P值结果判定B12.9413.286+B22.8313.163+B32.4952.788+B42.4272.712+B52.4162.700+B62.4792.770+B72.7013.018+B81.7932.003+B92.6642.977+B102.4522.740+B112.6052.911+B
20、122.7893.116+20190324编号A值S/P值结果判定A12.93203.183+A22.34102.542+A32.79703.037+A43.03303.293+A52.68002.910+A63.14903.419+A73.26103.541+A82.93803.190+A93.03803.299+A102.63802.864+A112.73502.970+A123.00403.262+A132.76903.007+4、ASFVELISA抗体检测试剂盒的临床应用（三）-引种筛查评估引种场1：血液抗原、抗体双阴性，引种安全引种场2：血液抗原阴性，部分抗体阳性，有风险三、三、AS
21、FVELISAASFVELISA抗体检测技术的研究及应用抗体检测技术的研究及应用4、ASFVELISA抗体检测试剂盒的临床应用（四）-病因综合分析三、三、ASFVELISAASFVELISA抗体检测技术研究及应用抗体检测技术研究及应用p猪场情况：2019年3月初开始发病，存栏7000头育肥猪场，发病后剩余860头，6月份猪群稳定，9月20号部分后备母猪和怀孕母猪陆续出现发烧、咳嗽、喘气、皮肤发绀，部分怀孕母猪流产，发病7-10天后部分猪死亡，采集血样检测非瘟和伪狂犬。p检测结果：10月5号送检16份血样，非瘟抗体100%阳性，病原检测均为阴性；PRVgE、gB抗体均100%阳性，综合分析确诊为PRV引起。如何鉴别野毒感染和疫苗免疫抗体?姓名：郭小参职务：销售总监Tel：13303719792Email：
