1、著（收稿日期：2 0 2 3-0 3-13）678脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第11期2008,181(8):57305737.14Contentti EC,Correale J.Neuromyelitis optica spectrumdisorders:from pathophysiology to therapeutic strategiesJ.JNeuroinflammation,2021,18(1):208.15Holroyd KB,Manzano GS,Levy M.Update on neuromyelitis opticaspectrum disorderJ.Cur
2、r Opin Ophthalmol,2020,31(6):462-468.16Tradtrantip L,Yao X,Su T,et al.Bystander mechanism forcomplement-initiated early oligodendrocyte injury in neuromyelitisopticaJ.Acta Neuropathol,2017,134(1):35-44.17Buonacera A,Stancanelli B,Colaci M,et al.Neutrophil to lymphocyteratio:an emerging marker of the
3、 relationships between the immunesystem and diseasesJJ.Int J Mol Sci,2022,23(7):3636.18Zhou Y,Xie H,Zhao Y,et al.Neutrophil-to-lymphocyte ratioon admission is an independent risk factor for the severity ofneurological impairment at disease onset in patients with a firstepisode of neuromyelitis optic
4、a spectrum disorderJJ.NeuropsychiatrDis Treat,2021,17:1493-1503.19Xie H,Zhao Y,Pan C,et al.Association of neutrophil-to-lymphocyteratio(NLR)with the prognosis of first attack neuromyelitis opticaspectrum disorder(NMOSD):a retrospective cohort studyJJ.BMCNeurol,2021,21(1):389.20孙庆利，孙阿萍，傅瑜，等.全身免疫炎症指数与
5、视神经脊髓炎谱系疾病活动的相关性 J.中国神经免疫学和神经病学杂志,2 0 2 2,2 9(5):36 2-36 5.21Du Y,Li K,Liu W,et al.Recent Advances in neuromyelitisoptica spectrum disorder:pathogenesis,mechanisms and potentialtreatmentsJJ.Curr Pharm Des,2022,28(4):272-279.22Liu J,Tan G,Li B,et al.Serum aquaporin 4-immunoglobulinG titer and neuromy
6、elitis optica spectrum disorder activity andseverity:a systematic review and meta-analysisJ.Front Neurol,2021,12:746959.PI3K通路发挥抗氧化应激在大鼠脑缺血/再灌注损伤保护机制探讨蒲天强刘树改龙燕玲梁秋霞刘宏【摘要】目的本研究分析磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K)通路发挥抗氧化应激在大鼠脑缺血/再灌注（I/R）损伤保护机制；方法喂养SD大鼠，制作脑I/R损伤模型，然后随机分为非抑制剂组、低剂量抑制剂组和高剂量抑制剂组3组，分别于持续给药7 d之后、14d之后处死各组大鼠7 只和
7、8 只，对其脑部组织进行提取，分析和比较不同组别大鼠脑组织中抗氧化酶活性及PI3K激酶、一氧化氮（NO）、B淋巴细胞瘤-2（bcL-2）基因、磷酸化蛋白激酶B（P-A K t）的表达量。结果发现给药前，三组的丙二醛（MDA）、化学需氧量（COD）的表达量无明显差异（P0.05），不同剂量的两组抑制剂组，MDA、CO D 的表达量明显高于给药前，且高剂量组比低剂量组的MDA、CO D 的表达更高（P0.05）。给药后，高剂量组和低剂量组PI3K、NO、Bc l-2、p-A k t 与非抑制剂组比，表达比较差异有统计学意义，且高剂量组与低剂量组之间比较差异有统计学意义（P O.05),the ex
8、pressions of MDA and COD in the two inhibitorgroups with different doses were significantly higher than before,and the expressions of MDA and COD in the high-dose group were higher than those in the low-dose group(P 0.05).After administration,the expressions of PI3K,NO,Bcl-2,p-Akt in high-dose and l
9、ow-dose groups were significantly different from those in non-inhibitor groups,and therewere also differences between high-dose and low-dose groups(P 0.05).Conclusion Ingestion of inhibitors intothe brain with ischemia/reperfusion injury may reduce oxidative damage of cerebrovascular cells by inhibi
10、ting PI3Kpathway,thus playing a protective role against cerebral ischemia/reperfusion injury.Key wordsPhosphatidy linositol 3-kinase pathway:Antioxidant stress:Rat experiment;Cerebral ischemia/reperfusioninjury磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol3-kinase,PI3K）信号转导通路能够抑制多种刺激所致的细胞调亡，维持细胞存活。既往研究证实PI3K/信号通路与脑
11、缺/血再灌注(ischemia/reperfusion，l/R）损伤有关1-41，但具体机制尚不明确。因此，本文通过制造模型和抑制剂给药（PI3K抑制剂低剂量和PI3K抑制剂组高剂量组）来分组研究抗氧化酶活性和大鼠脑组织当中PI3K、一氧化氮（nitric oxide，NO）、B淋巴细胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）磷酸化蛋白激酶B（p h o s p h o r y l a t e d p r o t e i nkinaseB，p-A k t）的表达量，探讨其神经保护作用，旨在探究PI3K信号传导通路对大鼠脑梗死的作用机制，以期为再灌注损伤的防治提供基础实验依
12、据。材料与方法1.实验动物与试剂50只健康的SD大鼠，雄性，体质量16 0 g200g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SCXK（湘）2 0 2 1-0 0 0 2。采取脑缺血手术造模，以最终的造模情况为依据对成功造模的大鼠进行分组，一组为非抑制剂组，一组为PI3K抑制剂低剂量组，一组为PI3K抑制剂高剂量组，面向三组分别灌药。设置安置环境，温度为2 2.9 至2 3.1，湿度为45%，等时间光暗循环，且保证实验前5d能够获取食物与水。整个实验过程符合国家卫生健康指导中心相关规定。实验试剂：购自普瑞发公司的Curcumin（9 8%）；anti-jak2、a n t i-p-j a
13、 k 2、a n t i-p-s t a t 3等所需一抗均购自sant cruz公司；anti-Bax、a n t i-b c l 2 抗体均购自CST公司。2.实验动物模型制作大鼠行腹腔麻醉，使用10%3ml的水合氯醛麻醉，将大鼠以仰卧姿势固定，取大鼠颈前正中部1.0cm1.5cm的切口，于气管两侧对颈总动脉缓慢剥离，待完成穿线处理之后留待备用。庆大霉素2滴进行滴注并缝合。将大鼠以俯卧位置固定，取大鼠后背第1颈椎正中位置切1 2 cm水平口，钝性分离肌肉、筋膜，将突孔充分暴露视野下。于大鼠腹腔内注射2.5ml生理盐水作诱导麻醉，待大鼠四肢瘫软至完全状态取出大鼠，作仰卧固定并拆除颈部位置的缝
14、合线，待大鼠恢复清醒后提起预埋备用线，采用微创动脉法使双侧颈总动脉夹闭，由此实现阻断大鼠脑供血，经再灌注之后缝合切口。手术结束后，大鼠单独在2 6 左右环境下饲养。3.实验动物分组面向成功建模大鼠来进行随机分组，包括非抑制剂组、PI3K抑制剂组低剂量组和PI3K抑制剂组高剂量组共计三组。其中，非抑制剂组采取的是680脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第11期生理盐水灌胃的方式，而另外两组的区别则在于剂量，高剂量组对应的是6 gkg静脉滴注，低剂量组对应的是3gkg静脉滴注。分别于持续给药7 d之后、14d之后处死各组大鼠7 只和8 只，对其脑部组织进行提取，以供检验之用。4.观察指标动物
15、模型成功与否的评定：在与如下标准相一致的情况下即视作成功建模：面向大鼠在夹闭其双侧颈动脉后，经过数十秒时间挣扎之后随之昏迷，意识丧失，瞳孔散大的同时，光反射也随之丧失，将固定大鼠放开可观察到其四肢上举，角弓反张，且未有翻正反射现象的发生。在处于夹闭缺血期时，大鼠的呼吸虽然是在一个平稳的状态下，但意识及前文提到的反射则并未得到恢复，且偏瘫或癫痫的现象也并未出现。光学显微镜应用下，海马CA1区细胞呈异常结构和散乱的细胞排列，而且椎体细胞的变性成为一个突出的现象。实验过程当中大鼠有发生两种情况之一者，即视作建模失败，一个是身体抽搐情况，一个缺血期间死亡。抗氧化酶活性分析：由分光光度法应用下对组织丙二
16、醛（malondialde，M D A）化学需氧量（chemicaloxygen demand，CO D）水平的分析来充当指标。对于535nm时丙二酰硫脲与MDA、CO D 反应所产生颜色相对应光吸收值的测量依靠引人光吸收值来实现。以nmol/g组织蛋白来作为MDA、CO D 单位。蛋白印迹实验（Westernblot，W b）检测大鼠脑组织中PI3K、NO、Bc l-2、P-A k t 的表达量。脑缺血1h之后行时长为3h的再灌注操作，后即刻将下部脑组织取下，使用足量生理盐水作冲洗操作，血液流经主动脉，注射TTC（1%）直至变红为止，作时长为2 0 min的液氮速冻操作。完成组织匀浆操作之后
17、检测脑部组织，作剁碎处理，使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液进行裂解，于12 0 0 0的转速下作时长2 0 min的离心操作，进行收集。引人BCA法来支持对蛋白浓度的测定，一次完成加样、电泳和转膜。使用脱脂牛奶（5%）进行封闭，于4环境下行一抗的孵育，且抗体滴度除anti-jak2、anti-p-jak2为1:50 0 之外，其他均为1:10 0 0。用2 0吐温的Tris作连续三次的缓冲洗涤操作，于室温条件下完成对二抗（1:12 0 0 0）的孵育，整个孵育过程用时9 0 min。引人凝胶成像系统与增强化学发光检测试剂。引人ImageJ软件来支持定量分析。5.统计学方法采用SPSS20.
18、0软件进行数据分析，计量数据以（s）表示，引人Bonferroni多重比较法支持，以P0.05），不同剂量的两组抑制剂组，MDA、CO D 的表达量明显高于使用前，且高剂量组比低剂量组的MDA、CO D 的表达更高（P0.05）.3.Wb检测PI3K、NO、Bc l-2、p-A k t 表达量（表2）表2Wb检测PI3K、NO、Bc l-2、p-A k t 表达量对比组别时间PI3KNOBcl-2p-Akt生理盐水灌胃后7 d67.34 14.43123.24 23.3435.35 8.434.34 2.24非抑制剂组生理盐水灌胃后14d65.63 13.54118.45 20.3133.34
19、 7.684.56 2.67低剂量抑制剂组给药后7 d59.45 11.30*154.34 25.46a30.30 4.28*4.98 1.32a给药后14d49.32 14.57ab167.37 33.63a21.32 6.57b5.12 2.63a高剂量抑制剂组给药后7 d53.45 13.25a177.40 174.57a22.40 5.19a5.14 1.57a给药后14d33.57 19.37*b198.57 187.21a*b16.57 4.37 a*bh4.23 1.31 a*b681脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第11期经分组给药前后，Wb检测PI3K、NO、Bc l
20、-2、p-Akt表达量，发现给药前，各组的Wb检测PI3K、NO、Bc l-2、p-A k t 表达量无明显差异（P0.05）；给药后，高剂量组和低剂量组PI3K、NO、Bc l-2、p-A k t与非抑制剂组比，和高剂量组与低剂量组之间差异有统计学意义（P0.05）。讨论脑内动脉阻塞引起的缺血性卒中可导致局部血液供应障碍，占所有脑血管疾病的6 0%8 0%5-6 。脑缺血后I/R会加重脑损伤，即I/R损伤。本研究构建了缺血性脑损伤动物模型7，该试验在国内外多个报道中常见，方法成熟，成功率较高，本研究模型组纳入的50 只大鼠中，达到了9 2%的成功造模率。一般来说，机体在发生缺血性脑损伤后，相
21、伴发生的还有原发性损伤。目前临床上对于缺血性脑损伤会采用降压、外科手术等常见的干预手段 8-9 ,虽然效果显著，安全性也逐步提升，但临床上发现此类患者的继发性损伤比例较高，因此目前对缺血性脑卒中的基础性研究和分子学研究较为密集。缺血性脑损伤的发生目前研究中大多认为与炎症反应、氧化应激机制有较为明显的关系。不管是哪一种损伤机制，都会造成机体血脑脊液屏障被破坏 10 。一方面，缺血期间适度的自噬能够保护细胞免受代谢应激和氧化损伤，并产生能量以促进细胞存活 0 ；另一方面，I/R发生后的12 2 4h，自噬水平将达到高峰，如果发生过度自噬而不受控制，将引发大面积脑梗死。但也有研究证明，自噬抑制剂3-
22、甲基腺嘌岭会加重缺血性脑损伤 12 。机体存续下，呼吸与能量产生随之相伴。这种反应本质上是依赖于氧气的参与来完成的。聚焦于该过程，自由基这一高活性分子会于细胞当中出现，而且氧化应激也随之相伴。PI3K信号通路作为氧化应激反应的信号转导通路的典型代表十分关键，且在癌细胞当中这一通路的表达也有着普遍的异常表现 3。PI3K信号通路亦属于抗凋亡通路的一种，发挥着十分重要的作用。在内皮细胞内亦是如此。相关研究显示，处于激活状态的内皮细胞能够支持生成更多的NO，由此依靠氧化应激反应来对内皮细胞损伤发挥诱导作用。另有研究所持的观点是 14,Bcl-2在线粒体膜上进行定位，属于P13k/Akt下游的一种具有
23、代表性的抗调亡蛋白，p-Akt依靠对Bad磷酸化所具有的促进作用。来支持Bcl-2/Bcl-x复合物当中Bad游离的实现，这样，不仅形成了对Bad促调亡效用的一定抑制，还为Bcl-2应有抗凋亡作用发挥提供助力。有研究学者认为，正常状态下活性中间体毒性的清除与活性氧的产生之间是存在着某种平衡的，而氧化应激的出现则会打破这一平衡，且某些时候甚至会达到失控的程度。在其影响之下，机体内存在的细胞大分子均要受其所累，随之导致的氧化损伤也具有不可逆的特点。此时如干预手段低效，则便会导致细胞凋亡的结局15-16。由此便需要解答一个疑问，即是怎样的机制支持了氧化应激、氧化损伤两者间形成了联系？本研究结果发现给
24、药后，高剂量组和低剂量组PI3K、NO、Bc l-2、p-A k t与非抑制剂组比，表达差异明显，且高剂量组与低剂量组之间也存在差异（P0.05），提示PI3K信号通路确实在脑缺血这一疾病进展中起到一定的作用；在出现细胞死亡这一现象时，则表明炎症反应步入新阶段。死亡细胞能够释放出诸多的危险信号，在这些信号的作用下，再次将免疫系统进行激活，从而诱导白细胞向脑部的转移，并通过脑部浸润，来赋予炎性损伤的恶化，并最终造成一系列的严重后果，典型的如脑细胞大量损伤、脑组织损伤等。就以I/R脑损伤作为基础所导致的炎症反应来看，与之相关的一系列信号通路得到激活，促/抗炎性基因不论是在表达还是在释放上均得到增强
25、，且在整个病程中氧化损伤与修复均随之相伴 17 。本实验结果显示，三组大鼠作持续给药后，炎症得到激活之后会释放出趋化因子、自由基等多种化学物质。在缺血性脑损伤出现大概1d时间之后，红细胞的断裂引起了毒性更高物质的释放，典型的如血红蛋白、铁等，由此导致了脑损伤情况的进一步恶化。可见，通过抑制氧化应激和炎症情况，可以起到对脑I/R损伤进行保护作用。利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突作者贡献声明蒲天强、刘宏：负责整体实验设计和文章写作；刘树改、龙燕玲：负责实验操作；梁秋霞：负责数据统计分析参考文献1Ghadami E,Dadkhah T,Akhavan-Niaki H.PI3k/AKTsignal
26、ing pathway:Erythropoiesis and beyondJ.J Cell Physiol,2019,234(3):2373-2385.2胡盛寿，高润霖，刘力生，等.中国心血管病报告2 0 18 概要中国循环杂志，2 0 19;34(3):2 0 9-2 2 0.3Shaw LJ,Blankstein R,Brown DL,et al.Controversies in diagnosticimaging of patients with suspected stable and acute chest painsyndromesJ.JACC Cardiovascular ima
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34、J.Mol Neurobiol,2017,54(4):2579-2584.TBK1在高级别脑胶质瘤髓样细胞中的表达特征李媛媛纪乐张劲然李忠尧李春岩 刘亚坤【摘要】目的探讨TANK结合激酶1（TBK1）在高级别脑胶质瘤髓样细胞中的表达特征。方法选取2 0 19 年4月至2 0 2 1年2 月就诊于河北医科大学第二医院的2 7 例WH0分级标准为高级别胶质瘤患者作为研究对象，采用磁珠分选的方法检测胶质瘤瘤旁和肿瘤组织中整合素M（CD 11b）阳性髓样细胞中TBK1的表达，免疫荧光染色观察肿瘤微环境巨噬细胞中磷酸化TBK1（p-T BK 1）的表达，并通过流式细胞分析患者术前1d、术后10 14d外
35、周血经典单核细胞中p-TBK1的表达变化。结果高级别胶质瘤肿瘤组织CD11b阳性细胞中TBK1总蛋白表达水平较瘤旁组织明显增多（P=0.006）；高级别胶质瘤肿瘤组织中p-TBK1蛋白水平较瘤旁明显升高，且p-TBK1的表达与CD68阳性巨噬细胞有共定位；高级别胶质瘤患者术后外周血经典单核细胞中p-TBK1表达较术前明显降低（P=0.001）。结论TBK1在高级别胶质瘤微环境髓样细胞中高表达，提示髓样细胞TBK1在胶质瘤的发展中可能起着关键调控作用。【关键词】高级别胶质瘤；髓样细胞；TANK结合激酶1中图分类号：R739.4文献标识码：A文章编号：10 0 6-351X（2 0 2 3）11-0 6 8 2-0 5Characteristics of TBK1 expression in high-grade glioma myeloid cellsLi Yuanyuan,Ji Le,Zhang Shaoran,Li Zhongyao,Li Chunyan,Liu Yakun基金项目：河北省自然科学基金资助项目（H2022206105）作者单位：0 50 0 0 0 石家庄，河北医科大学第二医院神经内科（李媛媛、张劭然、李忠尧、李春岩、刘亚坤）；河北医科大学第一医院神经外科（纪乐）通信作者：刘亚坤，Email:
