1、课题3 血红蛋白的提取和分离 血红蛋白含有四条肽链,每条肽链环绕一个亚 铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二 氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。 一、基础知识: 学生活动1: 1 、分离生物大分子的基本思路是什么？ 2 、不同蛋白质的特性在哪些方面存在差异？ 3 、本课题我们将利用血红蛋白与杂质蛋白哪方面的 差异进行提纯？ 4 、为什么不用鸡的血红细胞而用人的血红细胞作为 实验材料？ 5 、用什么方法分离相对分子质量不同的蛋白质 ？ 一、基础知识-蛋白质提取和分离原理 蛋白质提取与分离的依据蛋白质的物理化学 性质： 形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性 质、亲和力等千差万别。
2、 提取 分离 方法 凝胶色谱法 凝胶电泳法 （1）原理： （2）材料 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。 多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 (一)凝胶色谱法 （3）分离过程 混合物 上 柱 洗 脱 大分子流动快 小分子流动慢 收 集 大分子 收 集 小分子 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋 白质分子的差速流动。 (一)凝胶色谱法 1、什么是凝胶？ 2、什么是凝胶色谱法？ 学生活动2: 3、凝胶色谱法的原理是什么？ 4、请用自己的话总结出凝胶色谱法分离相对分子质 量不同蛋白质的具体过程。 1 、什么是缓冲液？ 2、 缓冲
3、液的作用是什么？ 学生活动3: 3、 缓冲液是如何配制的？你所学过的人体 血液的缓冲物质有哪些？ 4、 本实验加的是什么缓冲液？为何要加缓冲液？ （二）、缓冲溶液 由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。 如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸钠， NaH2PO4/Na2HPO4等 缓冲溶液洗脱剂 组成： 配制： 作用： 调节缓冲剂的比例，可配制不同pH的缓冲液。 抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定 。 （二）、缓冲溶液 1 、什么是电泳？ 2、 影响电泳迁移速度的因素有哪些？ 学生活动4: 4、电泳分离各种分子的原理是什么？ （三）、电泳 3、 如何消除电荷对电泳迁移速度的影响？ 5 、请描
4、述电泳的过程？ 2凝胶电泳法： （1）原理： 不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小 不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力 不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运 动速度不同。 影响蛋白质分子运动速度的因素 (三)电泳 1.电泳的概念 指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程. 影响蛋白质分子运动速度的因素 决定 运动方向 形成 库仑力 形成 阻力 决定 运动速率 电荷性质 电荷量 分子形状 分子大小 在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电 ；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质SDS复 合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 （2）分离方法： （3）分离过程： 琼脂糖凝胶电泳、
5、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 (三)电泳 二、实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步： （1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白释放； 离心分离等操作收集到的血红蛋白溶液。 （2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。 （3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋 白质除去。 （4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。 （一）样品处理 1、红细胞的洗涤： 目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝 固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用 生理盐水洗涤。 2、血红蛋白的释放： 在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放 3、分离血红蛋白溶液： 离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏 斗分出红色透
6、明液体。 4、透析：装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0 ）透析。 样品处理 粗 分 离 纯 化 纯度鉴定 血液组成成分 1.洗 涤 红 细 胞 2.释放血红蛋白 3.分离血红蛋白 4.透析血红蛋白 二、实验操作 跳转 血液组成成分 阅读思考： 1. 血液由_和_两部分组成。 2. 血细胞中_细胞数量最多，红细胞的含 量最高的有机化合物是_。 血浆血细胞 红细胞 血红蛋白 返回 1.洗 涤 红 细 胞 阅读思考：洗涤的目的是什么？ 洗涤过程： 血液 100mL 3g柠檬酸钠 低速离心 2 min 红细胞 血 浆 吸出血浆 红细胞 5倍体积生理盐水 搅拌10min 重复洗涤3次，直至上清液
7、没有黄色 2.释放血红蛋白 阅读思考： 1. 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了 哪些物质？ 2. 为了加速释放过程，采取了什么措施？ 目的分析： 蒸馏水的作用是_。 加入甲苯的作用是_。 充分搅拌的目的是_。 使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂 (2)血红蛋白的释放： 加蒸馏水到原血液体积，再加40体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破 裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。 磁力搅拌器 返回 3.分离血红蛋白 分离过程 红细胞 混合液 高速离心 10min 离心管 滤纸 过滤 脂类物质 烧杯 (3)分离血红蛋白溶液： 过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以 2000r/min的速度离心10 min。 试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层 （无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀 层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白 的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）： 杂质沉淀层（暗红色）。 分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于 分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体 。 甲苯层（无色透明） 白色薄层固体 红色透明液体 杂质沉淀层（暗红色） 试管中溶液层次 返回 4.透析血红蛋白 20mmol/L磷酸缓冲液 1mL 1mL
