1、北京朝阳医院 肾内科 陈向东 ARBARB的肾脏保护作用的肾脏保护作用 慢性肾脏病 （Chronic Kidney Disease） 肾损害3个月，伴/不伴肾小球滤过率 （GFR）的降低，表现为： 有肾脏病理异常，或 有肾脏损害的指标，如血、尿检查异常 ，或影像学检查异常 GFR60ml/min/1.73m2 3个月， 有或无肾损害 K/DOKI（Kidney Disease Outcome Quality Initiative） ：American Journal of Kidney Diseases, February 2002 CKD的分类 根据诊断 疾病 主要类型（例如） 糖尿病肾病
2、非糖尿病肾病 移植性疾病 1型和2型糖尿病 肾小球疾病 (自身免疫性疾病，全身感染 ，药物，瘤形成 ) 血管疾病 (大血管疾病，高血压，微血管病 ) 小管间质性疾病 (泌尿道感染，结石，阻塞，药物毒性 ) 囊性病 (多囊性肾病 ) 慢性排斥反应 药物毒性(环孢霉素或 他克莫司) 复发性疾病(肾小球疾病) 移植性肾小球病 微白蛋白尿累积发生率(%) K/DOKI（Kidney Disease Outcome Quality Initiative） ：American Journal of Kidney Diseases, February 2002 CKD的分期 分期描述GFR(ml/min/1
3、.73m2) 1有 ，GFR正常或升 高 90 2有 ，GFR度60-89 3GFR中度 30-59 4GFR重 15-29 5衰竭15(或透析) K/DOKI（Kidney Disease Outcome Quality Initiative） ：American Journal of Kidney Diseases, February 2002 CKD持续进展的主要原因 高血压 蛋白尿 肾小球内细胞增殖和细胞外基质积 聚 高血压的高血压的 严重程度严重程度 慢性肾脏疾病（CKD）进展历程 150120906030150 GFR ml/min/1.73m2 微量白蛋白尿微量白蛋白尿 大量白蛋
4、白尿大量白蛋白尿 高血压和蛋白尿 是慢性肾脏病进展的重要危险因素 第1阶段 高灌注 第2阶段 肾功能轻度 第5阶段 ESRD ESRD：终末期肾病，即需要血透或肾移植 第3阶段 肾功能中度 第4阶段 肾功能重度 Segura J,et al. Kidney Intern 2004; 92（Suppl）: S45-S49 心血管和肾脏心血管和肾脏 危险危险 AII 受体 (AT1亚型) 血管收缩 血压升高 醛固酮分泌 交感神经激活 血管紧张素原 A I A II 肾素血管紧张素系统(RAS)的作用机制 血管紧张素II对肾小球血液动力学的影响 Angiotensin II ()Angiotensi
5、n II (+) 血管紧张素II引起出球小动脉的收缩，由于入球小动脉 NO的分泌，拮抗血管紧张素II的作用而不引起入球小动 脉收缩，肾小球内压力增高。 结果 肾小球出现病理改变：高灌注、高压力、高滤过 ECM成份 胶原沉积增加 金属蛋白酶 胶原降解减少 细胞外基质 成份积聚 金属蛋白 酶抑制剂 Ang-II TGF-1 mRNA TGF-1 溶酶体功 能 滤过蛋 白清理 肾脏组织结 构改变蛋白 漏出 蛋白尿 RAS的作用机制 PAI-1 血管紧张素II - 直接与间接的靶器官损伤 Ang 死亡 肾小球滤过率下降 蛋白尿/白蛋白尿 肾小球硬化 醛固酮增多 肾衰 左室肥大 纤维化 重塑 凋亡 血管
6、收缩 血管肥大 内皮功能障碍 动脉硬化 卒中 高血压 血栓 心律失常 心衰 心梗 AT1 受体 血管重构 Dzau VJ. J Cardiovasc Pharmacol. 1993;22(suppl 5):S1-S9. 2007 ESH/ESC 高血压指南指出 ： 防止肾功能不全进展的两项基本要求： a 严格控制血压（1 g/d则应更 低） b 降低尿蛋白水平，使其尽可能接近正常 严格控制血压： 目标血压越低， 肾功能衰退越慢 Bakris GL. Diabetes Res 1998;39(suppl):S35-42. 平均动脉压 (mm Hg) GFR 下降 (ml/min/year) -1
7、0 -8 -6 -4 -2 0 98100102104106108110 r = 0.66; p 0.05 对2型糖尿病肾病患者经过3 年以上的研究发现 多个大型心血管疾病的临床试验显示出血管紧张素 受体拮抗剂（ARB）对肾功能具有保护作用 因此 JNC7中ARB是慢性肾病强制性适应证 醛固酮拮抗剂强制性适应证利尿剂阻滞剂ACEIARBARBCCB 心力衰竭 心肌梗死后 冠心病高危因素 糖尿病 慢性肾病 预防中风复发 Chobanian A, et al. JAMA 2003;289:2560-72 2007 ESH/ESC 高血压指南指出 ： 2007 ESH/ESC高血压指 南指出，ARB
8、是肾功能 不全、蛋白尿、终末期 肾功能衰竭首选的抗高 血压药之一 2007 ESH/ESC 高血压指南. J Hypertens 2007; 25(6): 1105-87. 血管紧张素受体拮抗剂（ARB） 肾脏保护的机制 AII 受体 (AT1亚型) 血管舒张 血压下降 醛固酮分泌 降压作用的主要 机制: 抑制 A-II 与 AT1 的结合 交感神经激活 血管紧张素原 A I A II ARB * The clinical significance of this pathway has not been established AII拮抗(ARB)的作用机制 ARB独特肾保护作用的基础 高选
9、择性阻断AT1 出球动脉入球动脉 入球动脉舒张 AT1受体被阻断 出球动脉舒张 AT2受体兴奋 代文 ：对AT1受体亲和力最高、 AngII的阻断 作用最强的ARB J Hypertens Suppl,1997,15(7):S15-20. Drugs,2002,51:820-45. J Pharmacol Exp Ther,2001,265(2):826-30. 对AT1/AT2受体的选择性 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 缬沙坦 坎地沙坦 厄贝沙坦 替米沙坦 氯沙坦 30000 10000 8500 3000 1000 MARVAL研究 MicroA
10、lbuminuria Reduction with VALsartan 缬沙坦减少微量白蛋白尿研究 MARVAL研究设计 多中心, 双盲, 随机, 活性对照, 平行组研究 332例入组 缬沙坦组169例 80mg/天 氨氯地平组163例 5mg/天 缬沙坦组每日 平均剂量122mg 氨氯地平组每日 平均剂量8mg 完成试验 例数146例 完成试验 例数145例 048121824 -60 -40 -20 0 20 (p 0.001) -8% -44% AER的变化 代文 氨氯地平 时间(周) 两组降压疗效相同 代文显著降低白蛋白排泄率（AER） -11.2-6.6-11.6-6.5 SBPDB
11、P 与基线相比 24 周平均 BP 变化 Viberti G, Wheeldon NM, et al. Circulation. 2002;106:672-8 (mm Hg) (%) 代文氨氯地平 高血压亚组的血压改变和 UAER 百分比改变 Circulation. 2002;106:672-8 基线 SBP (mmHg) DBP (mmHg) 0 40 80 120 160 研究结束 SBP (mmH) DBP (mmH) 0 40 80 120 160 0 40 80 120 代文氨氯地平 基线48121824 p0.001 代文 (n=107) 氨氯地平 (n=109) 正常血压亚组的
12、UAER 百分比改变 0 40 80 120 基线48121824 p0.001 代文氨氯地平 Circulation. 2002;106:672-8 基线 SBP (mmHg) DBP (mmHg) 0 40 80 120 160 终点 SBP (mmHg) DBP (mmHg) 0 40 80 120 160 氨氯地平 (n=54)代文 (n=62) 代文 组有更多患者恢复至正常白蛋白尿水平 恢复至正常白蛋白尿*水平的患者 Circulation. 2002;106:672-8 0 5 10 15 20 25 30 35 P=0.001 与氨氯地平相比 14.5% 29.9% * 定义为
13、UAER 20 g/min (%) 代文 氨氯地平 MARVAL研究的主要结果 在2型糖尿病伴微量白蛋白尿患者中，与氨氯地平组相比，代文组 血压降低幅度相同 白蛋白排泄率（AER）显著降低 恢复至正常白蛋白尿水平的患者显著增多 均可降低正常血压和高血压亚组患者的AER 代文降低微细胞培养 及其 在肿瘤研究中的应用 一、细胞培养基础知识 （一）概念 细胞培养是在严格的无菌操作条件 下，从机体组织分离出细胞，在体外用 无菌的培养液及孵箱模拟机体的生理条 件，进行细胞离体培养，使之存活和繁 殖。其关键是要求严格的无菌和培养条 件。 （二）培养细胞的特性 1、细胞的生长方式及类型 (1) 贴附生长型细
14、胞 能附着于支持物表面生长的细胞。 上皮细胞型：形态类似上皮细胞的多种培养细 胞，来源于外胚层及内胚层。 成纤维细胞型： 起源于中胚层 。 （2） 悬浮生长型细胞 2、培养细胞的生长过程 （1）单个细胞的生长过程 细胞周期： 一个母细胞分裂结束后形成的细胞至其下 一次再分裂结束形成两个子细胞的这段时期，可 分为间期和M期（分裂期）两个阶段。 细胞周期 = 间期 + M期 = G1期 + S期 + G2期 + M期 （2）细胞系的生长过程 细胞系 有限（生长）细胞系 原代培养或初代培养期 为新鲜组织自体内取出后首次在体外培养 至第一次传代的时间，一般约1-4周。原代培养 是建立各种细胞系的第一步
15、。 原代培养的细胞刚刚离体，生物学特性未 发生很大变化，仍具有二倍体遗传物性（二倍 体核型）。原代培养的细胞与体内相应的细胞 性状相似，更能代表其来源组织的细胞类型及 组织特异性质，适合作药物测试、细胞分化等 实验研究。 原代培养细胞部分生物学特征尚不稳定， 如要做较为严格的对比性实验研究，还需对细 胞进行短期传代后进行。 传代期（细胞系阶段） 将原代细胞分开接种至2个或更多的新培 养器皿中，即传代。每进行一次分离再培养为 传一代。这种传代大约数天至1周左右即可重 复一次，持续数月，此即细胞系。 传代期的细胞增殖旺盛，一般仍然是二倍 体核型，并保留原组织细胞的很多特征。 衰退期 增殖变慢 停止
16、分裂 传代中偶尔可有极少后代细胞能通 过“危机期”，获得不死性而具有持久或 无限增殖的能力，这种细胞即称为无限 细胞系或连续（生长）细胞系。 （3） 每代细胞的生长过程 （三）细胞培养的基本设备和材料 1、细胞培养室的设置 无菌操作 孵 育 制 备 清 洗 消毒灭菌处理 储 藏 2、基本设备 （1） 超净工作台 水平式或外流式 垂直式或侧流式 （2） 二氧化碳培养箱 （3） 倒置显微镜 （4） 常用的消毒的培养器皿 玻璃培养瓶、培养皿 塑料培养瓶、培养皿 微载体 涂膜材料 中空纤维 （5） 培养液 培养基 天然培养基： 胎牛血清 新生牛血清 灭活处理： 加温到56，30min 5 %血清 保护
17、细胞 10%血清 细胞生长 15%血清 融合及克隆 20% 血清 冻存细胞 合成培养基： 基本成分 常用种类 RPMI1640 Eagle培养液 （MEM） BME（Basal Eagle Medium） DMEM（Dulbcco MEM） 培养用液 水、平衡盐溶液、消化液、缓冲液、 维生素液及用于检测的各种染液等。 （6） 细胞冷冻储存器 二、肿瘤细胞培养和应用 （一）细胞培养在肿瘤研究中的应用及意义 1、探索各种化学的、物理的和生物的因子 在肿瘤生命活动中的作用（单一的与综 合的作用）及过程。 2、提供基础，便于在分子生物学水平上对 细胞进行各项研究，尤其由于可获得纯 的均一性细胞，故可进
18、行分子杂交、电 泳等研究。 3、便于研究肿瘤细胞的结构和功能，尤其 便于研究单个细胞的结构。其中包括扫 描与透射电镜的研究。 4、培养细胞可长期保存及传代，以便观察 肿瘤细胞遗传行为的改变。 5、观察研究肿瘤的生物学行为及机制，如 侵袭转移。 6、建立肿瘤细胞体外分化诱导模型。 7、可用于快速筛选抗癌药物以及用于致癌 物、促癌剂、抗促癌剂的研究。 （二） 肿瘤细胞的取材和培养 1、肿瘤细胞的取材 （1）实体瘤手术标本取材注意事项 切取未经任何治疗和没有坏死的标本 无菌操作处理 标本及早浸入无血清培养液保鲜并及 时进行培养 （2） 体腔液标本的取材 （3） 血液标本取材 以外周血中的肿瘤细胞为培
19、养对象 抗 凝 去除RBC 离 心 悬浮培养 2、培养方法 （1） 组织块培养法 将组织剪切成小块后，接种于培养 瓶。 适合于组织量少的原代培养。 （2） 酶消化法 结合生化和化学手段把已剪切成较 小体积的组织进一步分散的方法，获得 的细胞制成悬液可直接进行培养。 适用于培养大量组织，原代细胞产 量高。 胰蛋白酶法 胶原酶法 EDTA法（二乙烯四乙酸二钠） （3）机械分散法 直接用机械方法进行组织细胞分散 。 3、传代肿瘤细胞培养的注意事项 （1）当癌细胞还没有生长到足以覆盖培 养瓶壁的大部分表面以前，应当耐 心等待，不要急于传代。 （2）从原代开始到10代左右期间，操作 慎重，确定适合该细胞
20、的培养方法 （3）在早期传代培养，应适当提高接种 细胞密度。 （4） 对增殖能力极低的细胞，可根据细胞 种类不同选用不同的促生长物质。应 用饲养细胞。 （5） 对癌细胞分离，进行选择性传代，消 除成纤维细胞 。 （三）培养中的细胞转化及肿瘤细胞 转化（transformation） 恶性转化（malignant transformation） 常见特点： 1、获得无限增殖能力或称之为永生性 （immortality） 2、产生了致癌性 3、生长密度依赖性（density-dependence）减低 4、停泊依赖性（anchorage- dependence）丧失 5、血清依赖性降低 6、 其它 形态改变 、核型改变，对外源凝集素如 ConA的凝集能力增强，对化学致癌物毒性作用 的抵抗力增强，纤维粘连蛋白（fibronectin）合 成减少以及胞质内cAMP水平降低等。 （四）培养肿瘤细胞的生物学鉴定 目的： 证明培养细胞是否来自原来的癌瘤细胞； 说明肿瘤组织类型； 描述肿瘤细胞的生物学特性。 常用培养肿瘤细胞的生物学检查项目如下： 1、组织起源 2、形态学观察 3、细胞生长特性 细胞生长曲线、细胞分裂指数、倍增时间及 细胞周期等。 4、软琼脂培养 5、细胞核型分析 核型特点、染色体数量，有无标记染色体、 染色体带型等。 6、动物致瘤试验 7、组织化学检查 8、其他生物学特性检测
