1、ICS 11.220 B 41 备案号： DB42 湖北省地方标准 DB 42/T 14722018 野生动物疫源疫病监测样品采集、保存 运输规范 Guideline of sample collection, storage and transportation for surveillance of epidemic diseases and their sources of terrestrial wildlifes （报批稿） 2018 - 10 - 09 发布 2018 - 12 - 19 实施 湖北省市场监督管理局 发 布 DB42/T 14722018 I 目 次 前言 . II
2、I 引言 . V 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 采样前的准备 . 1 4.1 采样要求 . 1 4.2 用品和试剂 . 1 5 样品的采集 . 2 5.1 样品采集对象 . 2 5.2 拭子的采集 . 2 5.3 粪便的采集 . 3 5.4 血液的采集 . 3 5.5 体液的的采集 . 4 5.6 乳汁、精液的采集（适用于哺乳动物） . 4 5.7 皮肤及其附属物的采集 . 4 5.8 组织的采集 . 4 6 样品的保存 . 5 6.1 拭子样品的保存 . 5 6.2 粪便样品的保存 . 5 6.3 血液样品的保存 . 5 6.4 体液的保存 . 5
3、 6.5 乳汁、精液的保存 . 5 6.6 皮肤及附属物的保存 . 5 6.7 组织样品的保存 . 5 7 样品的包装与运输 . 5 7.1 运输采集样品的包装 . 5 7.2 样品包装要求 . 6 7.3 样品运输要求 . 6 附录 A （规范性附录） 保存液的配制 . 7 附录 B （资料性附录） 野生动物疫源疫病监测样品采集样表 . 8 参考文献 . 10 DB42/T 14722018 II DB42/T 14722018 III 前 言 本标准按 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本标准由湖北省野
4、生动物疫源疫病监测中心提出。 本标准由湖北省林业局归口。 本标准起草单位：湖北省野生动物疫源疫病监测中心、武汉市蔡甸区沉湖湿地自然保护区管理局。 本标准主要起草人：陈婧、周席华、李勇、杨国祥、何武、张俊、陈光、章伟、徐凡、冯江。 DB42/T 14722018 IV DB42/T 14722018 V 引 言 依据陆生野生动物疫源疫病监测防控管理办法，为保护珍贵濒危野生动物物种，维护生态平衡，保障生态安全、公共卫生安全，随着野生动物疫源疫病监测工作深入开展，以及预警监测防控理念的提出与实施，野生动物样品采集、检测、分析已经成为野生动物疫源疫病监测工作的重要内容，是野生动物疫源疫病主动预警监测工
5、作的基础性工作。目前，畜牧、卫生、出入境等部门早已发布样品采集检测等相关法律法规或流程，林业部门尚未发布专门针对野生动物疫源疫病监测样品采集、保存、运输方面的规范或标准。野生动物样品、保存、运输有其特殊性，如采集方法不当操作有可能造成疫病传播、人员感染等严重后果；保存方法不当有可能造成病原提前死亡，影响检测结果。鉴于野生动物样品采集、保存、运输重要性和特殊性，野生动物样品采集、保存、运输规范或标准的发布，可以推动野生动物样品的规范化操作、规范化管理、个人安全卫生防护、疫病风险防控。 DB42/T 14722018 VI DB42/T 14722018 1 野生动物疫源疫病监测样品采集、保存、运
6、输规范 1 范围 本标准规定了野生动物疫源疫病监测样品采集的采样前准备、 样品的采集、 样品的保存及样品的包装与运输。 本标准适用于湖北省陆生野生动物疫源疫病监测采样工作。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 DB42/T 9782014 陆生野生动物疫源疫病监测及技术规范 3 术语和定义 野生动物疫源疫病监测样品 samples for epidemic disease and source monitoring of wildlife 指为开展陆
7、生野生动物疫源疫病监测工作而采集的， 用于动物疫病溯源排查、 野生动物疫病预警监测、分析野生动物异常死亡原因等而采集的与野生动物相关的样品。 4 采样前准备 4.1 采样要求 野生动物疫源疫病监测样品采集要遵守以下要求： a) 采样人员应是野生动物监测技术人员，或经过野生动物监测部门认可的专业技术人员； b) 开展采样工作前，应了解、 掌握采样区域内动物的种类数量、 活动规律、生活习性及保定方法，制定样品采集、运输和保存等完整的技术方案，并办理样品采集和运输相关手续，确保采样过程的科学性和安全性以及样品的可溯源性。 若要抓捕活体动物采样， 还应按照相关法律法规要求办理野生动物猎捕许可； c)
8、采样安全与防护。采样人员应按要求穿戴全套个人卫生安全防护装备做好自我防护。与样品直接接触的器具均要无菌处理防止样品被污染。 应准备垃圾袋带回采样过程中产生的所有废弃物品， 防止环境污染和疫病传播； d) 采样完成后，所使用的器械、容器、个人防护用品等均要进行无害化处理。无害化处理方法可参照 DB42/T 9782014 中 7.7 条。 4.2 用品和试剂 4.2.1 样品采集用品 个人防护装备，包括但不限于防护服、乳胶或聚乙烯手套、+/-N95 或 FFP2 面罩、护目镜、胶鞋或DB42/T 14722018 2 鞋套等。 样品采集及记录用品，包括但不限于装有保存介质的采样管或无菌空容器、动
9、物检疫器械箱、人造纤维或聚酯纤维棉签、剪刀、镊子、注射器（带针头） 、酒精棉、碘伏棉、酒精灯、封口袋、标签纸、记号笔、记录表格等。 样品暂存运输装备，包括但不限于保温箱、冰盒或液氮容器、吸水填充材料、包装胶带、警示标识等。 样品保存装备，包括但不限于低温冰箱（4、-20等） 、超低温冰箱（-80） 、液氮罐等。 保定用品，包括但不限于操作笼、防咬嘴套、眼罩等，必要时采取药物保定。 4.2.2 药品试剂 病毒保存液，如加抗生素等渗磷酸盐缓冲液（PBS） ，其配制方法， （见附录 A.1） ；细菌保存液，如加 30%甘油生理盐水缓冲液，其配制方法， （见附录 A.2） ；福尔马林，即 35%37%
10、的甲醛溶液。 5 样品的采集 5.1 样品采集对象 活体样品采集之前应选取合适的野生动物保定措施， 保证人员与野生动物安全， 必要时可采取药物麻醉保定。一般采集拭子、粪便、血液、体液、乳汁、精液、皮肤及其附属物等样品；体重小于 150g（含）的可直接活体送检。 死亡的大型野生动物采取典型病变部位的组织 （包括体液） ； 死亡的小型野生动物可直接采集整尸。 5.2 拭子的采集 5.2.1 肛拭子的采集 肛拭子采集步骤如下： a) 根据动物大小选择合适的棉签， 从包装袋的茎秆底部打开聚酯纤维棉签， 小心避免接触棉签头； b) 取出棉签， 将棉签在生理盐水或 PBS 中浸湿， 对肛门消毒后， 把整个
11、棉签头插入肛门或泄殖腔，温和地施压，棉签头在泄殖腔旋转 24 次； c) 抖落大于 0.5cm 的粪块,打开冻存管，把棉签头插入运输介质（保存液）中距离冻存管底部约3/4 的位置； d) 拧断（或剪断）棉签，使棉签可以完全放入管中并拧紧管盖，整个拭子头和部分茎秆留在冻存管中； e) 在冻存管上做好标记，样品编号、注明样品类型（肛拭子/泄殖腔拭子）； f) 填写样品采集记录表（见附录 B 表 B.1），详细注明样品编号、类型（肛拭子/泄殖腔拭子）、采集的日期、物种、年龄、性别、地点等信息，确保冻存管上的信息与样品采集记录表上的一致。 5.2.2 咽拭子的采集 咽拭子采集的步骤与肛拭子采集相同，
12、采样时轻柔地把棉签头插入动物的口腔中， 在咽部旋转棉签取样即可。 5.2.3 眼部拭子的采集 提起眼睑，用湿润的灭菌棉拭子在其表面轻轻刮拭采集眼部分泌物样品，做好标记和记录。 DB42/T 14722018 3 5.2.4 鼻腔拭子的采集 将湿润的灭菌棉拭子插入鼻腔收集分泌物样品，做好标记和记录。 5.3 粪便的采集 采集粪便时需选取新鲜粪便， 尽量采取粪便内部未被氧化部分， 不成形粪便应避免采取粪便中的白色部分。采集粪便时用棉签蘸取粪便放入采集管中，每采集一个样品更换一个棉签。做好标记和采样记录，不同地点的粪样分别放置，同一个地点的样品可密封在一个袋子内。 5.4 血液的采集 5.4.1 血
13、液采集量 在不影响动物种群数量的原则下，采集的血清样品不少于 10 份，保护级别较高的动物可根据实际情况采集。 动物的安全采血量为每 100g 体重 0.3ml0.6ml。体重低于 500g 的动物总采血量不能超过最大安全采血量，其他动物，每份样品不少于 1.5ml 。 5.4.2 血液采集方法 血液采集方法主要有静脉血采集法和心脏采血法， 其中静脉血采集法适用于个体较大， 血管分布明显，血液充盈的陆生野生动物。心脏采血法适用于无法通过静脉采集到适量血液的陆生野生动物个体。动物的常见采血部位见表 1。 表 1 动物常见采血部位表 动物种类 大型偶蹄动物 毛皮动物 猴 类 鼠 类 兔 鸟 类 采
14、血部位 耳静脉 颈静脉 前腔静脉 耳壳外侧静脉 前臂静脉 后肢隐静脉 尾尖 耳背静脉 眼窝内血管 耳背静脉 颈静脉 心脏 颈静脉（颈部右侧）臂/尺脉（翼静脉） 跖骨静脉（腿部内侧） 5.4.2.1 静脉血采集步骤 静脉血如采血量过少，可使用注射器，使用负压采血管采集步骤如下： a) 拨开准备采血部位的毛发或羽毛，用酒精棉球擦拭采血部位； b) 按住静脉近心端位置可看到血管充盈； c) 针尖斜面朝上与血管呈一定角度从远心端进针； d) 小心调整针头位置，看到回血时用一只手拇指固定住针头，另一手将采血针的另一端插入采血管收集血液； e) 采集完血液后，用干棉球按在进针位置，拔出针头，继续按压 1m
15、in2min； f) 将采血针从采血管上取下，弃于含消毒液的利器收集桶中； g) 对采血管进行编号，记录样品信息，填写样品采集记录表（见附录 B 表 B.1）。 5.4.2.2 心脏血采集步骤 心脏血采集步骤如下： DB42/T 14722018 4 a) 用麻醉剂将动物麻醉，将动物仰卧，清理口腔，防止动物窒息； b) 检查动物身体，寻找体表反应心脏跳动最明显区域，并进行皮肤消毒（必要时可剃毛）； c) 选择大小适宜的注射器及针头，在心脏跳动明显（心搏最强）处进针，当刺中心脏时，血液会自动进入注射器，即针管前端有回血； d) 看到回血时用一只手固定住针头，另一手缓慢抽取，抽到适量血液后，拔出注
16、射器及针头； e) 取出采血管，将注射器针头插入采血管，将血液沿内壁缓缓推入采血管内； f) 对采血管进行编号，记录样品信息，填写样品采集记录表（见附录 B 表 B.1）。 5.5 体液的的采集 只采集有检测需求的濒死或死亡动物的体液，直接用无菌注射器抽取欲采集的体液（尿液、腹水）后注入灭菌好的采样管内。 5.6 乳汁、精液的采集（适用于哺乳动物） 乳汁：采样前用清水清洗乳头，弃去最初流出的乳汁，用无菌容器收集中段乳汁作为样品。完毕后做好标记和记录。 精液：通过人造阴道、人工刺激等方式采集精液样品，做好标记和记录。采集和储存容器避免接触消毒液，防止样品的生物活性被破坏。 5.7 皮肤及其附属物
17、的采集 以灭菌注射器吸取完整水泡中的水疱液置于灭菌管，若水泡破裂，可采取水泡皮。检验螨、虱子或真菌时先清除表皮上的毛发或羽毛，用解剖刀刮取深层皮屑。做好标记和记录。 5.8 组织的采集 5.8.1 采集前准备 采集组织样本前， 应先了解动物死亡前的临床症状或同种群其他动物的活动和行为状况， 并对动物尸体进行体表检查， 初步判断重点采样组织。 5.8.2 采集原则 同一种群动物，一般采集死亡动物个体不少于5只。应遵循先实质脏器（心、肝、脾、肺、肾）再腔肠脏器（胃、肠、膀胱等）的原则采集。对有明显病变的脏器组织，应采集病变部位与健康部位交接处的组织样本。 5.8.3 采集部位 每只动物通常采集肠管
18、及肠内容物、喉头、气管、心、肝、脾、肺、肾、脑、法氏囊等，上述每种样品取样重量为 15g20g，如重量不够则取整个脏器，用平皿或自封口样品袋收集，样品数量按动物个体数量计为 1 份。 5.8.4 采集要求 不同动物脏器不能混装，同一只动物的不同种脏器也不能混装。每个样品包装上都要做好标记，并填写相应的采样记录表。 对可以整尸采集的动物，将死亡动物装入干净无破损的塑料袋内，至少用两层塑料袋包装，并保持04下，12h 之内送到实验室。同一种群动物，一般采集死亡动物个体不少于 5 只。对种群数量较DB42/T 14722018 5 少或保护级别较高的动物，可根据实际死亡数量采集。做好死亡动物的标记，
19、并填写采样记录表。 6 样品的保存 6.1 拭子样品的保存 用于病毒检测的肛拭子、咽拭子和泄殖腔拭子应保存在 pH 值 7.07.4 的病毒运输介质中，加入复合抗生素冷冻保存，避免反复冻融。 用于细菌检测的拭子，应保存在加细菌保存液或生理盐水的无菌采样管内，冷藏保存，并在 48h内进行检测。 6.2 粪便样品的保存 粪便应置于无菌的螺盖试管或封口塑料袋中保存， 运送时间超过 24h 或者用于寄生虫检测的样品应在 4下保存。仅用于病毒检测的粪便可使用含有抗菌素的保存液放置-20或-80保存。 6.3 血液样品的保存 抗凝血保存在 4，保存时间宜12h。 全血不能长时间保存，若要进行免疫学方面的检
20、查，宜将血液中的血清提取出来保存。 将血液 37静置 1h 后，置于 4 3h4h 析出血清或低速离心取血清。 一周内进行检查的血清可置 4保存，若长时间保存宜将血清放入-20或-80冰箱冻存。 6.4 体液的保存 直接收入灭菌瓶中冷藏保存。 6.5 乳汁、精液的保存 用于血清学检测的乳汁样品不可冻存、加热或者剧烈摇晃，不能及时送检时可以加入防腐剂；用于病毒中和试验检测的乳汁不能添加防腐剂。用于细菌检测时需要冷藏。 精液保存方法与乳汁相同。 6.6 皮肤及附属物的保存 用来检测寄生虫的皮肤及附属物样品直接常温送检； 用于检测病毒的样品可冷冻保存； 用于细菌检测的样品冷藏保存即可。 6.7 组织
21、样品的保存 组织样品采集后应尽快冷藏保存，用于进行细菌检测的组织应尽量避免冷冻，保存时间应48h。用于病毒检测或用于提取 DNA/RNA 的组织应在-80（及以下）冻存，保存时间应180d。 用于制作病理切片或者实体标本的组织应立即用福尔马林液固定。 固定的好的组织连同福尔马林液一起常温保存即可，不能冻存。 7 样品的包装与运输 7.1 运输采集样品的包装 DB42/T 14722018 6 包装时应保证样品在到达实验室时外观完整且在运输过程中不发生泄露。 样品的包装一般分成三个部分：承载容器、包装垫料和包装外壳。 7.2 样品包装要求 样品包装要求如下： a) 存载容器应密封无孔，且不能超过
22、外包装的质量限制。包装含有液体的样品时存载容器内应有防漏夹层。 包装可能含有高致病性疫源的样品时存载容器外要贴上封条和生物安全警示标志， 封条上要注明贴封日期，贴封人签章，并标注放置方向、最高叠放层数； b) 包装的填充材料要具有良好的吸附能力和防撞能力，防止样品在运输过程中受到外力损伤。有温度限制的样品还需在填充材料中加入冰袋、干冰块等降温材料； c) 包装外壳要坚固抗压，并具备一定的保温能力。样品信息和采样单要随包装好的样品一起放入外包装中； d) 组织样品先单个逐一包装标记，同一个动物的样品先集中装于一个密封袋内，再将样品统一包装放入存载容器内； e) 装有拭子样品的小离心管要放在离心管
23、盒内，或两层密封的塑料袋中，防止样品泄露。装有血清或其他体液样品要用专用塑料盒，或者不锈钢/铝盒存放。盒内加填充物防止容器晃动。 7.3 样品运输要求 样品运输要求如下： a) 样品的运输要根据样品特点及检测要求确定具体的运输方案； b) 样品的运输要符合国家相关法律法规程序； c) 样品运输时间应48h，特殊情况下，要根据待检对象要求和运输要求做相应处理； d) 样品移交应办理样品移交手续，并填写疫病报检记录表(见附录 B 表 B.2)。 DB42/T 14722018 7 A A 附 录 A （规范性附录） 保存液的配制 A.1 pH值 7.4 的等渗磷酸盐缓冲液（PBS）的配制 A.1.
24、1 pH值7.4的等渗磷酸盐缓冲液（0.01mol/l,pH7.4,PBS）的配制 NaCl 8.0g KH2HPO4 0.2g Na2HPO4.12H2O 2.9g KCl 0.2g 将上述试剂按次序加入定量容器中，加入适量蒸馏水溶解后，再定容至1000mL，调pH至7.4，高压消毒灭菌112kPa20min,冷却后，保存于4冰箱中备用。 A.1.2 棉拭子用抗生素PBS（病毒保存液）的配制 无菌状态下取上述PBS液，按要求加入下列抗生素：咽/气管拭子所用PBS液中加入青霉素（2000IU/ml）、链霉素（mg/ml）、丁胺卡那霉素（1000IU/ml）、制霉菌素（1000IU/ml）。粪便
25、和泄殖腔拭子所用的PBS中抗生素浓度应提高5倍。加入抗生素后应调pH至7.4。分装至小塑料离心管，每管中加入配制好的PBS1.0ml1.3ml，冷冻保存备用。采集粪便时，在西林瓶中加PBS1m1.5ml。 A.2 30%甘油生理盐水的配制 甘油30ml+NaCl 0.9g+蒸馏水至100ml，灭菌后分装备用。 DB42/T 14722018 8 B B 附 录 B （资料性附录） 野生动物疫源疫病监测样品采集样表 表B.1、B.2分别给出了陆生野生动物疫原疫病样品采集工作中常用的两种表格。其中，野外样品采集记录表是在监测工作中发现野生动物异常现象后， 用于记录被采样动物及采样活动中相关信息；
26、疫病报检记录表是将被采样集样品送交特定的检测机构时，用于记录动物及送检样品相关信息。 表B.1所示了陆生野生动物疫源疫病监测野外样品采集记录表用样表。 表B.1 野外样品采集记录表 编号： 年 月 日 年 月 日 动物名称 生境类型 地理坐标 采样地点 是否迁徙 物种 样品类别 样品数量 样品编号 容器种类 野生动物来源情况 捕获时间 捕获地点 人工养殖时间 人工养殖地点 饲料、饮水来源 养殖区附近的其他动物 有无与家禽家畜接触史 野生动物种群状况 野生动物免疫情况 与之密切接触的其他动物免疫状况 采样动物处理情况 填表人 负责人 填表单位 填表说明：1 编号: 规则为行政区划代码+年度+三位
27、流水号,如 420000+2014+001。 2 地理坐标：注明地理坐标体系，如 WGS84、BJ54 等。 3 样品数量：即取样动物的数量。 4 样品类别：为血液、组织或脏器、分泌物、排泄物、渗出物、肠内容物、粪便或羽毛等。 5 容器种类：样品的包装材质，如西林瓶、离心管、塑料袋等。 6 野生动物种群状况：填写野生动物种群数量、整体状态、有无异常表现及其所占比例等信息。 DB42/T 14722018 9 C 表B.2所示了陆生野生动物疫病监测报检记录用样表。 表B.2 疫病报检记录表 编号： 监测地点 日 期 异常地点 地理坐标 野生动物名称 采样动物数 样品种类 样 本 数 样品编号 包装种类 异常动物/样品接受单位 接收人签字 现场检测结果 备 注 填表人 填表单位 填表说明：1 样品种类：为尸体、血液、组织或脏器、分泌物、排泄物、肠内容物、粪便或羽毛等。 2 包装种类：样品的包装材质，如西林瓶、离心管、塑料袋等。 DB42/T 14722018 10 参 考 文 献 1 NY/T 765-2004 高致病性禽流感样品采集、保存及运输技术规范 2 SN/T 2123-2008 出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范
