1、第一节 基因工程及其技术（第3课时）u 教学目标1阐明基因工程的基本操作程序的第一步即目的基因的获取。2利用某种材料提取并鉴定DNA，掌握DNA粗提取和鉴定的原理和方法。u 教学重难点【教学重点】1掌握获取目的基因的方法。2DNA的粗提取和鉴定。【教学难点】1掌握获取目的基因的方法。2DNA的粗提取和鉴定。u 教学过程【新课引入】教师结合具体实例阐述基因工程的基本操作程序。1982年，第一个基因工程药物重组人胰岛素被批准上市。（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因及其表达产物的检测鉴定。【过渡】什么是目的基因？提示：目的基因主要是指编码蛋白
2、质的基因，如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。如何获取目的基因呢？【新知讲解】一、获取目的基因的方法（一）化学方法直接人工合成目的基因1DNA合成仪人工合成对于比较小的目的基因，在明确脱氧核苷酸序列后，可以通过DNA合成仪人工合成。2半合成法（1）适用对象：全基因或较大基因。采用化学合成成本昂贵，使用半合成法可以降低成本。（2）操作步骤（二）通过基因文库获取目的基因【学生活动】阅读教材9495页的内容，思考什么是基因文库？基因文库有哪些种类？每类基因文库是如何构建的？基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌可能分别含有
3、该种生物的不同基因，称为基因文库。包括基因组文库和cDNA文库。1基因组文库（1）含义基因文库是指含有某种生物体全部基因片段的重组DNA的克隆群体。（2）构建过程提问：如何从基因组文库中筛选目的基因呢？（3）筛选方法：一般采用核酸探针杂交的方法，将某基因的已知片段作为筛选的探针，在基因组文库中筛选含有目的基因的菌落，进行扩增、分离回收而获得目的基因。2cDNA文库（1）含义包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。（2）构建过程（3）应用构建合适的cDNA文库已成为获取真核生物目的基因的常用方法。【过渡】如何获得上述方法中所需要的基因组DNA或mRNA呢？3从细
4、胞中获得基因组DNA或mRNA的基本过程【拓展】转座子标签法获得目的基因1转座子（1）概念：染色体上一段可以移动的基因，其分子本质是一段能够插入寄主基因组新位点的特异的DNA。（2）存在：在原核生物中有大量转座子，酵母、果蝇以及哺乳动物等多种真核生物中也存在转座子。（3）特点在转座过程中，原来位置的DNA片段（转座子）并未消失，发生转移的只是转座子的拷贝。基因发生转座可以引起插入突变，使插入位置的基因失活并诱导产生突变型，或在插入位置上出现新的编码基因。2转座子标签法（1）概念：通过转座子在染色体上的插入和整合，把转座子作为基因定位的标签来检测出突变基因的位置和克隆出突变基因的方法。（2）利用
5、转座子克隆外源基因的主要操作步骤：已分离得到的转座子与选择标记构建成含转座子的质粒载体将含转座子的质粒载体导入目标生物基因组中利用PCR等技术鉴定转座子DNA以转座子序列为探针，筛选插入的突变体，分离转座子的两端相邻序列基因。二、DNA的粗提取和鉴定【教师活动】教师阐述：不同生物、不同组织细胞的DNA提取方法不同。提取DNA也应考虑对DNA纯度的要求和实验条件选择不同的方法。例如，提取质粒DNA常用碱裂解法获取质粒再提取DNA。1实验原理（1）利用DNA和其他物质在物理和化学性质方面的差异，提取DNA。（2）DNA和蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同。物质的量溶度为2 mol/L的N
6、aCl溶液物质的量溶度为0.14 mol/L的NaCl溶液DNA溶解析出蛋白质部分发生盐析沉淀溶解（3）DNA的性质2实验步骤【学生活动】阅读教材96页的实验内容，描述实验的流程，以及实验中用到的试剂的作用，例如柠檬酸钠、蒸馏水等。实验流程（1）材料的选取选用DNA含量相对较高的生物组织（以鸡血为例）。（2）制备鸡血细胞液取质量浓度为0.1 gmL-1的柠檬酸钠溶液100 mL和新鲜鸡血180 mL，注人500 mL烧杯中充分搅拌，混合均匀4冰箱内静置1天，使血细胞沉淀。（3）破碎细胞鸡血细胞液加蒸馏水用玻璃棒搅拌用垫有纱布的漏斗过滤收集滤液（4）溶解DNA取物质的量浓度为2 molL-1的N
7、aCl溶液40 mL加入滤液中，用玻璃棒沿同一方向轻轻搅拌，使其混合均匀，使滤液中的DNA充分溶解。（5）析出DNA取适量蒸馏水沿烧杯内壁缓缓加入，同时用玻璃棒沿同一方向轻轻搅拌。随蒸馏水的不断加入，NaCl溶液浓度会降低，DNA的溶解度会降低，烧杯中会有丝（絮）状物（含有一定杂质的DNA）出现。当丝状物含量不再增加时，停止加入蒸馏水。也可以在破碎细胞过滤后收集的滤液中，加入适量冷却的、体积分数为95%的乙醇溶液，DNA的丝状物会从滤液中析出。（6）DNA的鉴定溶解DNA，去除杂质：将分离的丝状物放入物质的量浓度为2 molL-1的NaCl溶液中，使其溶解，同时在物质的量浓度为2 molL-1
8、NaCl溶液中溶解度低的蛋白质会析出。在溶有DNA的溶液中滴加二苯胺试剂，沸水浴加热数分钟，溶液变成蓝色。3不同试剂的作用试剂作用蒸馏水加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破加到含DNA的2 molL-1的NaCl溶液中，使NaCl溶液的浓度下降析出DNANaCl溶液2 molL-1的NaCl溶液可以溶解DNA0.14 molL-1的NaCl溶液可以析出DNA乙醇冷却的、体积分数为95%的乙醇可以除去杂质以提纯DNA二苯胺鉴定DNA的试剂柠檬酸钠抗凝剂，防止血液凝固4注意事项（1）本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核。（2）实验中有4次搅拌，后两次搅拌均
9、需要朝一个方向，且搅拌要轻缓，防止DNA断裂，导致DNA不能形成丝（絮）状沉淀。（3）二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定效果。【课堂小结】1获取目的基因2DNA的粗提取和鉴定【课堂检测】1下列叙述不正确的是（ C ）A目的基因可以从自然界中分离，也可以人工合成BcDNA文库的构建过程需要用到逆转录酶C基因文库就是基因组文库DcDNA文库是包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合2（多选）提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子，如提取DNA就要利用它与RNA、蛋白质等在物理和化学性质方面的差异，去除其他成分。下列有关DNA的粗提取与鉴定的叙述，错误的是（ ABC ）A可用新鲜猪血代替鸡血做实验材料B鉴定DNA时将丝状物直接加人到二苯胺试剂中并沸水浴加热C收集、保存好剩余的二苯胺试剂，以备以后实验时继续使用D纯化提取DNA时，要控制NaCl溶液的浓度，以溶解和析出DNA3图1、2分别为“DNA的粗提取和鉴定”实验中部分操作示意图，下列叙述不正确的是（ A ）A图1中完成过滤后应向滤液中加入一定量的柠檬酸钠溶液B图2完成后要将玻璃棒上丝状物重新溶解到2 mol/L的NaCl溶液中进行后续鉴定C图1、2中加入蒸馏水的目的不同D图1、2中搅拌的目的不同 10 / 10
