1、第一节 基因工程及其技术（第4课时）u 教学目标1阐明基因工程的基本操作程序的主要包括基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。2结合模式图，掌握基因表达载体构建的方法和要求。u 教学重难点【教学重点】1列表比较目的基因导入不同受体细胞的方法、目的基因检测和鉴定的方法。2结合DNA指导蛋白质合成的过程，简述不同层次在目的基因的检测。【教学难点】1基因表达载体的构建方法。2目的基因导入不同受体细胞的方法。u 教学过程【新课引入】教师展示图片：引导学生思考：（1）获得目的基因的方法有哪些？（化学合成法、基因文库法）（2）上图中质粒和目的基因需要用哪种酶切割？哪
2、种酶连接在一起？（限制酶、DNA连接酶）【过渡】上图中携带目的基因的重组质粒需要具备哪些特点呢？【新知讲解】一、基因表达载体的构建教师阐述：人们构建的基因表达载体不仅要使目的基因进入受体细胞并有效表达，而且要能稳定存在且遗传给后代。（一）基因表达载体的组成【学生活动】阅读教材97页第一段的内容，结合图3-1-17思考基因表达载体需要具备哪些结构？这些结构分别有什么作用？提示：基因表达载体除含有目的基因外，还必须有复制原点、启动子、终止子、标记基因等。1启动子（1）本质：有特殊序列结构的DNA片段。（2）位置：目的基因的上游，紧挨转录的起始位点。（3）功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因
3、转录出相应的mRNA。2终止子（1）本质：有特殊序列结构的DNA片段。（2）位置：目的基因的下游。（3）功能：使转录在需要的地方终止。3标记基因初步筛选出接受了目的基因的受体细胞。常用的标记基因有抗性基因（如抗生素抗性基因）或某些生化标记基因。4复制原点能与特定的受体细胞相匹配，使外源基因在受体细胞中能稳定复制并遗传。【易错辨析】启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别启动子终止子起始密码子终止密码子化学成分DNA片段mRNA上三个相邻的核糖核苷酸位置目的基因上游目的基因下游mRNA的首端mRNA的尾端作用RNA聚合酶识别和结合的部位决定转录的终止翻译的起始信号决定翻译过程的终止（二）基因
4、表达载体的构建过程【教师活动】该部分内容采用讲授法达成教学目标。教师强调：基因表达载体的构建是基因工程操作的核心。1用一定的限制酶切割载体，使其出现一个有黏性末端的切口。2用同种的或产生相同黏性末端的限制酶切割目的基因。3加入适量DNA连接酶，使切下的目的基因片段拼接到载体的切口处。【难点突破】关于限制酶的选择基因表达载体的构建过程中，一般用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因和载体，以获得相同的黏性末端（或平末端)，便于二者进行连接。但有时可用两种产生不同黏性末端的限制酶切割载体和目的基因，这样可使目的基因定向插入载体，同时可避免载体与载体之间、目的基因与目的基因之间的自身连接和目
5、的基因与载体之间的反向连接。【拓展】基因工程中的载体1载体的概念：载体是将外源DNA或基因导入寄主细胞进行扩增或表达的工具。2载体的种类：按功能分为克隆载体和表达载体两类。有一些兼有克隆载体和表达载体的特点。（1）克隆载体最基本的载体。来源：从病毒、质粒或高等生物细胞中获得的DNA均可以作为克隆载体。过程：在克隆载体上插入适当大小的外源DNA片段将重组后的载体引入宿主细胞在宿主细胞中通过克隆获得目的基因。（2）表达载体概念：要使外源基因（目的基因）能在宿主细胞中表达，必须将它放入带有基因表达所需要的各种调控元件的载体中，这类载体称为表达载体。举例：表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构
6、的大肠杆菌质粒，其基本骨架由来自pBR322和pUC的质粒复制起（原）点、氨苄青霉素抗性基因、相应的启动子和终止子，以及多克隆位点构成。二、将目的基因导入受体细胞【学生活动】阅读教材9798页的内容，梳理将目的基因导入不同受体细胞的方法有何不同？各自的转化过程是怎样进行的？用流程图的方式绘制出来。受体细胞类型方法植物细胞农杆菌转化法哺乳动物细胞显微注射法（主要）病毒感染法微生物细胞Ca2+处理法（感受态细胞法）【教师活动】根据学生绘制的流程图补充讲解。（一）将目的基因导入植物细胞提问：为什么选用农杆菌？农杆菌有什么特点？1原理（1）农杆菌农杆菌是一类生活在土壤中的原核微生物，能在自然条件下感染
7、双子叶植物或裸子植物，但不会感染大多数单子叶植物。（2）当双子叶植物或裸子植物收到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌向伤口处移动。（3）农杆菌含有Ti质粒，上面有一段转移DNA（T-DNA），能进入受体细胞，并整合到受体细胞染色体DNA上。2过程3特点经济、有效，适用于双子叶植物和裸子植物。（二）将目的基因导入哺乳动物细胞1显微注射法2病毒感染法用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。（三）将目的基因导入微生物细胞1感受态细胞经过适当的处理（如用Ca2+处理）后，细胞质膜对DNA的通透性会发生改变，细胞变得容易接受外来的DNA
8、，处于这种状态的细胞称为感受态细胞。2过程【易错辨析】1在将目的基因导入受体细胞之前，都必须进行基因表达载体的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子，而不是直接导入目的基因。2对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性而且容易表现全能性。3对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到限制。4大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核生物，而酵母菌为真核生物（具有多种细胞器），所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势。三、目的基因及其表达产物的检测鉴定1检测与鉴
9、定的内容、方法【学生活动】阅读教材9899页的内容，根据表格提示的项目填写表格中缺少的内容。检测水平检测内容方法结果显示分子水平的检测DNA检测转基因生物的染色体上是否插入了目的基因DNA分子杂交法（基因探针+待测转基因生物的DNA）是否显示出杂交带RNA检测目的基因是否转录分子杂交技术（基因探针+待测转基因生物的mRNA）蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交个体水平的检测包括抗虫、抗病的接种试验，抗冻的耐寒试验，以确定是否有抗性及抗性程度；基因工程产品需要与天然产品进行活性比较等2分子杂交技术的原理与过程【教师活动】讲授分子水平检测的原理和方法。（1）DNA分子杂交技术原理：具有一
10、定同源性的两条DNA单链，在一定条件下（适宜的温度等)可以按照碱基互补配对原则形成双链。过程与结果：提取待测转基因生物细胞中的DNA与用放射性同位素或荧光标记的已知DNA片段（基因探针）进行杂交若待测DNA中有能与基因探针互补的特异性DNA片段，用于示踪的放射性同位素标记或荧光标记会指示出其所在的位置，表明目的基因已经插入转基因生物的DNA分子中。（2）DNAmRNA分子杂交技术原理：碱基互补配对原则。过程与结果：提取待测转基因生物细胞中的mRNA用已标记的目的基因片段作为探针与mRNA杂交如果有杂交带出现，表明目的基因转录出相应的mRNA分子。（3）抗原抗体杂交技术原理：抗原与抗体的特异性结
11、合。过程与结果：提取待测转基因生物细胞中的蛋白质，并与相应的抗体进行杂交如果有杂交带出现，说明目的基因已经表达出相应的蛋白质。【易错辨析】抗原抗体杂交技术中目的基因产生的蛋白质是抗原还是抗体？（抗原）四、从植物组织中提取DNA【设计意图】由于从植物和动物中提取DNA的原理和思路类似，因此对于原理部分可以略过，直接进入实验实施环节，重点可以放在讲解植物不同于动物组织DNA提取的地方。1破碎细胞，获取DNA滤液（1）向研钵中加入5 mL物质的量浓度为2 molL-1的NaCl溶液、洗涤剂23滴，快速充分研磨草莓果实。（2）用一层纱布过滤，取滤液。2除去滤液中的杂质（1）向滤液中加入物质的量浓度为0
12、.14 molL-1的NaCl溶液，用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌，直至有丝状物出现。（2）将含有DNA丝状物的溶液过滤，呈黏稠状的DNA丝状物留在滤纸上。（3）将滤纸上的黏稠物移至15 mL物质的量浓度为2 molL-1的NaCl溶液中，用玻璃棒轻轻地沿一个方向不停地搅拌，使黏稠物尽可能多地溶于溶液中。3DNA的析出向含DNA的NaCl溶液中加入等体积的冰乙醇，至出现白色丝（絮）状物。4DNA的鉴定取两支试管，首先都加入5 mL物质的量浓度为2 molL-1的NaCl溶液和二苯胺试剂，其次一支加入白色丝（絮）状物，另一支作为对照组，混合均匀后置于沸水浴中5 min。观察颜色变化。【思考讨论】1在
13、处理植物组织时需要进行研磨，且常加入石英砂其目的是什么？提示：目的是研磨充分，破碎细胞壁，使核物质溶解在NaCl中。2研磨植物组织时加洗涤剂，目的是什么？提示：加洗涤剂的目的是溶解细胞质膜、核膜，释放出细胞内含物。【课堂小结】1将目的基因导入受体细胞的三种类型2目的基因检测与鉴定的“两个水平”【课堂检测】1运用转基因技术，将奶牛细胞中编码凝乳酶的基因转移到大肠杆菌细胞中，达到大规模生产凝乳酶的目的。下图表示用作运载体的质粒和目的基因所在DNA片段。下列操作与实验目的不符的是（ B ）A用限制酶BamH、Pst和DNA连接酶构建基因的表达载体B用含氨苄青霉素的培养基筛选出的即为导入目的基因的细菌
14、C可用PCR技术大量扩增目的基因D用Ca2+处理大肠杆菌使其易于转化2下图表示一项重要生物技术的关键步骤，X是获得外源基因并能够表达的细胞。下列有关说法错误的是（ C ）AX是能合成胰岛素的细菌细胞B质粒应具有多个限制酶切点C基因与运载体的重组只需要DNA连接酶D该细菌的性状被定向改造3下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述正确的是（ D ）A的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与B侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到的染色体上C的染色体上若含抗虫基因，则就表现出抗虫性状D只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异4为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是（ C ）A用限制性核酸内切酶EcoR和连接酶构建重组质粒B用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞C在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞D用DNA分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上 14 / 14
