1、动物病毒学试验技术杨润德 通过病毒学的学习，我们了解到病毒没有完整的酶系统，体内无核糖体等细胞器，因此不能在任何无生命的培养液中生长。所以要想增殖病毒必须在有生命的组织细胞内接种让其增殖，如：动物、鸡胚、细胞、器官。实验一、鸡胚接种 发育中的鸡胚是病毒生长良好的环境，被广泛用于病毒（特别是禽病毒）的分离培养和疫苗生产等。病毒在鸡胚中的生长可以通过几种方法加以测定，如：采集尿囊液、羊水、绒尿膜、鸡胚作定量检定；采集以上样品作血凝滴定、血清学试验等；检查各部的病理学变化，如：鸡胚死亡、矮小、出血、羽毛发育不良、内脏坏死灶、绒尿膜水肿或增厚、坏死性痘斑、出血。除鸡胚外，根据病毒特点可以选用其他禽胚，
2、如小鹅瘟病毒宜接种鹅胚，鸭瘟宜接种鸭胚等。影响病毒在鸡胚中生长的因素，包括鸡胚的日龄、接种途径、接种剂量、接种浓度、培养时间、培养温度。培养温度一般为35.5-37，有些病毒所需的温度更低。但很多哺乳动物病毒不适合在鸡胚中生长。1.选取SPF鸡群所产的蛋；2.受精卵在10左右保存不超过10d；3.最好选择白色卵壳的受精卵；4.卵壳无污染，孵化前在0.1%的新洁尔灭中浸泡约15min，最后用冷水冲洗，放卵架，或将卵放卵架用甲醛（1m2用13ml甲醛、6.5gKMnO4熏蒸，而且在熏蒸时维持箱内温度为3720min后驱散甲醛蒸汽；5.孵化温度保持39-40，相对湿度60-65%，有风扇维持空气流通
3、，每天翻蛋3-4次。一、受精卵的质量和孵化 根据不同病毒的嗜性，选择适宜的接种途径。最常用的途径有卵黄囊、尿囊腔、尿囊膜3种途径，偶尔接种于羊膜腔、静脉、胚体等。在分离一种未知病毒时，最好3种途经均用，如果没有足够的受精卵，首选绒尿膜接种途径，因为大多数病毒都能适应。接种材料的处理：将组织置研钵磨碎，加5-10倍盐水并加入双抗混均，2000-3000r/min离心20-30min。取上清待用。二、接种途径 卵黄是胚胎的营养物质，卵黄囊膜是由内胚层发育而来的，内层覆有一层绒毛。病毒可在绒毛细胞内生长，并且可以由此扩散到胚胎的其他部位。卵黄囊 1.取5-8日龄鸡胚，在照卵器上画出气室和胚胎的位置；
4、2.直立于卵座上，于气室部碘酊消毒后打孔；3.用注射器取病料直刺入3cm回吸，如有卵黄吸出，推入毒液0.2-0.5ml，拔出针头封口。放孵化器中继续孵化，每天照卵2-3次。接种方法 尿囊是鸡胚的排泄器官。腔内充满排泄物尿囊液。液体的容量因卵的大小而异，一般6日龄鸡胚时约1ml，11日龄时约6ml，13日龄可高达10ml，以后逐渐减少直到消失。13日龄时的尿囊液是无色透明的，14日龄后逐渐变浑浊，呈乳白色，有时淡黄色。尿囊腔接种 1.取9-10日龄鸡胚，照卵，画出气室，离气室边缘0.3-0.5cm用铅笔作一记号；2.在气室做记号处用碘酊消毒，打孔；3.用注射器取毒液自接种孔斜刺入约1cm，注入毒
5、液0.1-0.2ml；4.封孔继续孵化，定时照蛋。接种方法 绒尿膜是鸡胚的呼吸器官，由尿囊膜和绒毛膜紧密粘合组成，无法分开。绒尿膜上有丰富的血管，照蛋时清晰可见。绒尿膜接种 方法一 将待检液滴在气室膜上，透过卵膜扩散到绒尿膜上。原理是气室卵膜性脆，刺破后不再闭合，而绒尿膜是活组织，有韧性刺破后能立即闭合，接种液不能透过。接种方法 1.取9-10日龄鸡胚，照卵器画出气室范围；2.将卵直立于卵架上，气室向上，于中央消毒打孔；3.以1ml注射器配以2.5cm5-6号针头，自小空刺入气室约0.5cm，滴加待检液0.1-0.2ml于气室内的卵膜上，将针头继续垂直刺入，拔出针头，封口，继续孵化定时翻蛋。可
6、随意放置。方法二 此法做人工气室，能保证毒液接种在绒尿膜上。1.取9-10日龄鸡胚，画出气室及胚胎位置中的无血管区；2.将卵横卧于卵架上，胚胎位置向上；3.在胚胎部位及气室部碘酊消毒，气室中央打孔，胚胎部位用钢锯划破卵壳但不破坏绒尿膜；4.用橡皮吸球吸气室部的空气，使卵内容物移向气室，促使破壳部位的绒尿膜下陷，形成人工气室；5.自人工气室接种待检物0.1-0.2ml；6.将卵壳移回原位或用灭菌玻璃纸封口用胶布固定；7.将卵放回孵卵箱继续孵育，人工气室向上，每日检卵2-3次。检查 鸡胚接种待检材料后孵化1-6d，此期间每天最少检卵2次。接种24h死亡胚一般视为非特异性死亡，弃去。以后死亡胚立即取
7、出放置4内至少4h，以使血管收缩。冷藏时间不得超过24h，否则胚液蒸发，气室卵膜难于剥离，影响病毒的收获。三、鸡胚接种后的检查和收获 鸡胚内容物的收获 1.尿囊液的收获 将卵直立于卵架上，气室向上；气室部碘酊消毒，击破并除去卵壳；用灭菌镊子撕去气室部的卵膜及绒尿膜，可见尿囊液澄清透明；用吸管或注射器采集尿囊液，菌检弃去细菌污染的尿囊液。2、羊水的收获 1-4与尿囊液的收获一样；吸取尿囊液后用镊子提起羊膜，用细吸管刺入羊膜腔吸取羊水。3、绒尿膜的收获 1-3与尿囊液收获相同；用小剪刀剪取气室部的绒尿膜，观察病变并收获；吸取尿囊液，将卵黄倒入平皿，剪断卵带收取绒尿膜低温保存。4.卵黄囊的收获 1-
8、4与尿囊膜的收获同；将卵内容物全部倒入平皿中；用镊子夹住卵黄带，剪断，将卵黄囊提起，置于另一平皿内，刺破卵黄囊，用生理盐水洗去卵黄，将卵黄囊低温保存。实验二、细胞培养 细胞非常娇嫩，在体外培养时生长液中不能含有任何对细胞有害的物质，而且与细胞接触的玻璃器皿应不含有任何对细胞有害的物质。目前市场上有灭菌的一次性使用的96孔、24孔、12孔板及细胞培养瓶。在研究病毒时要大量增殖病毒，一次性瓶太昂贵，因此要求使用玻璃器皿，但它要经过洗涤与消毒后方可使用，并可重复使用。1、玻璃器皿的清洗 在组织培养中工作量最大的莫过于清洗玻璃器皿。清洗的玻璃器皿要求干净透明、无油渍，而且不能含有任何毒性物质，毒性物质
9、包括解体的微生物、细胞残余物以及非营养性的化学物质，有些化学物质仅百万分之一毫克，就会对细胞产生毒性作用，因此新购置的以及使用过的器皿要进行严格的清洗。一、器材的洗涤与消毒 浸泡 新购置的玻璃器皿其上带有干固的灰尘，同时生产的原因，使其常呈碱性并带有毒性物质如：铝和砷等，所以使用前用5%盐酸浸泡，以中和其中的碱便于清洗。用过的器皿往往有大量的蛋白质附着，用后立即清洗浸泡。刷洗 浸泡后的器皿于洗涤剂中用毛刷洗去玻璃上的杂质。酸浸 刷洗不掉的极微量的杂质，经过清洁液浸泡的强氧化作用被除掉。清洁剂对玻璃器皿无腐蚀作用。去污十分有效，是清洁过程中关键的一环。清洁液使用重鉻酸钾、浓硫酸、水按一定比例配制
10、而成，浸泡时溶液要充满容器，不要留有空气。配制时，要将重鉻酸钾溶于水中，再缓慢加入硫酸，加硫酸时不要过急，因其产热过大，会有危险，清洁液呈棕红色，遇有机溶剂或水分增多时变绿，失效。强 次强 弱重鉻酸钾 63g 120g 100g硫酸 1000ml 200ml 100ml水 200ml 1000ml 1000ml 冲洗 酸浸后用水充分冲洗用洗涤剂彻底清洗，不留任何残迹，至少每瓶用水灌满倒掉重负12次，再用蒸馏水冲洗3次，双蒸水冲洗3-5次晾干备用。2、朔料器皿的清洗 先用清水浸泡冲洗，用2%NaOH浸泡过夜，自来水冲洗，再用5%盐酸浸泡30min，自来水冲洗，蒸馏水冲洗3次晾干，用70-75%乙
11、醇冲洗37晾干备用。3、胶塞的清洗 用水浸泡，2%NaOH煮沸10-20min，自来水冲洗，再用1%盐酸浸泡30min，流水冲洗，蒸馏水漂洗，晾干备用。组织培养最重要的是防止微生物污染：其来源组织已受污染；操作时空气流动；操作者的疏忽；培养用具消毒不严。因此组织培养一定要严格消毒措施。消毒随物品的不同采用不同的方法：物理灭菌法 化学灭菌法二、消毒1、紫外线：对空气、朔料器皿，消毒效果与距离密切相关，一般维持30min。2、干热灭菌法3、湿热灭菌法4、过滤除菌5、消毒剂，来苏、新洁尔灭、乙醇是最好的消毒剂。用来消毒桌、椅、天花板、地板，操作者的皮肤，乳酸对空气消毒十分有效。6、包装。其目的是防止
12、再次污染。1、HanKs液2、乳汉液3、0.4%酚红：酚红0.4g，0.1mol/LNaOH2.85ml，将酚红于乳钵中，加入NaOH研磨至全部溶解，加去离子水至100ml，装瓶灭菌备用。4、0.25%胰蛋白酶，用无钙镁离子的磷酸盐平衡盐水配制，并用NaHCO2将PH值调至7.8，过滤除菌分装备用。三、溶液的配制 0.02%EDTA液，商品名为Versene，是一种螯合剂，与钙镁离子形成稳定的复合物，从而使组织细胞松散，常用于使细胞从玻面脱落。配制方法，EDTA0.2g加无钙镁磷酸盐平衡盐水1000ml，溶解后分装，高压灭菌备用。有时0.25%胰酶与0.02%EDTA等量混合，消化效果更好。5
13、、199、1640、MEM、DMEM按说明书配制。6、犊牛血清，其含10多种氨基酸、激素、无机盐类及一些未知成分。不加血清的营养液，细胞不能贴壁，且生长不良。使用前56灭活30min，加入的量因细胞种类不同而异，5-10%。7、抗生素，青、链霉素，配制成1万单位或1万g/ml，使用时在营养液中加入1%。庆大、卡那霉素，广谱抗菌素，抗霉形体且稳定，能耐高压灭菌，营养液浓度50-100 g/ml。制霉菌素、两性霉素，配制成1000 g/ml-20保存，使用剂量为5-10 g/ml，视细胞耐受程度调节。应用胚胎或幼小动物的组织制备培养，因其分裂旺盛，易生长。各种动物的大多数组织都能在体外培养，最常用
14、的有肾、睾丸、肺、皮肤等。本试验以鸡胚为例：1、取10-11日龄鸡胚，气室部消毒，用无菌镊击破蛋壳，除去卵壳、卵膜；2、将鸡胚移入无菌平皿中，用无菌剪、镊去头、脚、翅、内脏、眼睛，用Hank,s也洗2次，移入三角瓶中，剪成1-2mm2小块用Hank,s洗3次。四、原代细胞培养3、按3-5倍加入胰酶，于37作用30min，每10min摇一次，静置后弃去胰酶。洗2次加入含血清的营养液或乳汉液，吹打数次。4、用2层或4层纱布过滤于离心管中，800转/分离心10分钟，取沉淀。5、按1：200-250加入营养液分装培养瓶或96孔板，于37 静置培养。五、传代细胞培养 由于遗传突变或在理化学物质的作用下，
15、组织细胞中有时出现恶性变细胞，即癌变细胞。这种癌变细胞具有很高的生长和增殖势能，而且几乎可以无限传代。固称传代细胞系。其染色体已经发生改变，不再是二倍体细胞，故称异倍体细胞。有人体或动物体取得肿瘤组织进行培养，比较容易获得传代细胞系。传代细胞的传代，将长满单层的细胞用消化液洗3次，消化细胞并使其从瓶壁上脱落下来，敲打细胞培养瓶，使细胞分散，加入2-3倍的营养液，分装细胞培养瓶，静置培养。待长成单层待用。实验三、病毒的接种及检查 不同病毒接种于细胞的时间不同待细胞生长成单层后接种病毒；细胞分装培养12h后接种病毒；病毒与细胞同步接种培养。1、将病料制成1：10匀浆，加入双抗，3000转/分，离心
16、30分钟或15000转/分离心5-10分钟，取上清待接种。2、取不同生长时期的细胞，弃去细胞培养液，按1：10接种病毒材料37吸附1/2-2h，使病毒吸附于细胞膜上。3、弃去病毒液，加入维持液，于37静置培养。4、逐日在显微镜下检查CPE，或进行其他试验。接种病毒2天后，如维持液混浊，说明有细菌污染，弃去。实验四、空斑形成技术 1952年创立该试验方法，将10倍梯度稀释的病毒样本分别接种于单层细胞，而后在细胞上覆盖一层含营养液的琼脂，以防止游离病毒通过营养液扩散，但病毒可在细胞间传递。经过一段时间培养，进行染色感染病毒的细胞会形成一个近似圆形的斑点，类似固体培养基上的菌落，称为空斑或蚀斑。空斑
17、是细胞病变的一种特殊表现形式。一个空斑可能有一个以上病毒颗粒感染所致，因此可将获得的单个空斑制成悬液，梯度稀释后再作空斑，最终可以获得只含有一个病毒颗粒及子代的空斑，这就是病毒克隆。1、测定病毒液中病毒的含量（PFU计）。2、可以用来测定某病毒的特异性抗体及抗体效价。如：新城疫病毒稀释10-6，每毫升病毒液含100个PFU，即稀释液0.1ml含10个PFU，取培养好的细胞5瓶分别接种0.1ml的病毒稀释液，其中4瓶加入不同稀释倍数的血清，根据空斑形成的多少测定出抗体的有无及抗体的效价。3、可以获得病毒的纯培养物。空斑技术的利用可以达到的目的：4、不同病毒形成的空斑在大小、形态（规则的圆形、欠规
18、则的圆形、完全透明或不完全透明）、形成时间等可以有所不同，该特点有助于识别病毒，并可以此研究病毒的遗传变异。1、将细胞培养于扁瓶或平皿中，使其长成密集的单层，不能有空隙，吸去生长液，洗2次2、病毒用Hank,s液，做10倍连续稀释，每个稀释度接种2个培养瓶；3、37吸附60min，每15min转动一次；检查空斑形成的基本过程：4、加入融化冷却至45的营养琼脂覆盖单层2营养液2%琼脂混均（8ml）加在细胞的对面，翻转，37培养，根据接种病毒的不同，决定加入第二层的时间（48-72h 2营养液2%琼脂1：1000中性红，100g/ml混均7ml。加入的二层后继续培养，肉眼观察，空斑淡白色、背景淡红
19、色。2营养液2%琼脂1：1000中型红，100g/ml混均，将其加入细胞的对面翻转避光培养。逐日观察。1、琼脂的质量是空斑技术的关键，要使用高级琼脂或琼脂糖；2、琼脂融化后放50水浴；3、只要细胞不衰老，培养时间尽量延长，使空斑充分发育；4、中性红对细胞有毒性作用，因此可用2步法或培养后用0.01%中性红染色37 2h；5、中性红是光敏活体染料，感染细胞在可见光下培养不能产生正常空斑。观察时光线不宜过强，观察时间不宜过长，中性红现用现配。注意事项：实验五、病毒感染力的测定 感染力即毒力，可以用实验动物或鸡胚测定其半数致死量（LD50）或半数感染量（EID50）；另外可以使用组织培养细胞测定半数
20、细胞培养感染量（TCID50）。TCID50可用Reed-Muench法、内插法、或Karber法计算。本试验用Reed-Muench法。取长满单层细胞的96孔板，倒掉培养液，分别接种不同稀释度的病毒，每个稀释度接种8孔，每孔20l，吸附1h后每孔加入维持液20l，CO2条件下培养逐日观察，记录。病毒液稀释 细胞管数累计细胞管数 细胞管总数出现CPE空%有 CPE 无 CPE 有 CPE 无CPE10-1 8 0 27 0 27 10010-2 8 0 19 0 19 10010-3 7 1 11 1 12 91.610-4 3 5 4 6 10 4010-5 1 7 1 13 14 0.71
21、0-6 0 8 0 21 21 0病毒（NDV）在CPE上滴定其TCID50 高于50%的百分数-50高于50%的百分数-低于50%的百分数91.6-5091.6-4041.651.60.8 将此值加在高于50%死亡率的稀释度的对数上。因此被测病毒的TCID50应是将病毒作10-3.8，查反对数，得6310,即是将病毒液作6310倍稀释，稀释后每20l含有一个TCID50。由表可以看出该病毒株的TCID50在91.6%与40%之间，其确切的稀释倍数可按公式计算：实验六、病毒囊膜的检查 病毒的类脂主要存在于病毒的囊膜中，如果类脂溶解，囊膜即被破坏，致使病毒的感染力下降。病毒悬液用脂溶剂处理后如感
22、染力有明显下降即证明病毒有囊膜，最常使用的脂溶剂有乙醚、氯仿、去氧胆酸钠，其中氯仿的效果最稳定。步骤：1、氯仿法：病毒液20份氯仿1份混均4感作10min，2000转/分离心取上清待检。2、乙醚法：病毒液4份乙醚1份混均4过夜，2000转/分离心取下层待检。3、去氧胆酸酸钠：用0.75%牛白蛋白配置0.2%去氧胆酸钠，保存于4，用前放37，病毒液在做实验前用5000转/分离心1h。将病毒上清与去氧胆酸钠等量混合37 1h，放透析袋中用PB透析24h，每4h换液一次，目的是除去去氧胆酸钠对细胞的毒性作用。4、将取出的液体作10倍递进稀释滴定TCID50。5、每种方法均设对照。6、判定只要较对照组
23、低2个滴度即证明敏感。实验七、病毒理化特性测定1、取病毒悬液2ml于试管中50水浴30min,2、取同样病毒液4 30min作对照，3、2组病毒悬液分别用维持液作10倍稀释，4、用适宜的细胞测定其TCID50，较对照组低2个滴度即判为敏感。一、热灭活实验，首先提出作用温度。高浓度的二价阳离子MgCl2能使某些病毒在50稳定，不被灭活，但对某些病毒MgCl2没有保护作用，有时甚至增加对热的敏感性。步骤：1、病毒悬液1ml1mol/L MgCl2 9ml摇匀，2、病毒悬液1ml维持液9ml摇匀，3、放50水浴1h后，将2组病毒液分别进行连续10稀释，测定TCID50。二、阳离子稳定实验 PH3或5
24、 经30min作用后，有些病毒遭受损伤而使感染力降低，但有些病毒不受影响。1、病毒液1份PH3或5 Hank,s 9份混均，2、病毒液1份PH7.2 Hank,s 9份混均；3、在25水浴中感作30min；4、用0.1mol/LNaoH将实验组PH值调至7.2；5、2组分别作连续10倍稀释测定TCID50。6、实验组较对照组低2个滴度为敏感。三、酸敏感试验实验八、病毒中和试验 本试验极为特异、敏感，是病毒学中重要的血清学试验。主要用于病毒感染的血清学诊断；病毒分离株的鉴定；不同病毒株的抗原关系研究；疫苗免疫原性的评价；免疫血清的质量评价；测定实验动物血清中是否存在抗体等。中和试验的步骤因病毒不
25、同而变化，基本方法是病毒与血清混合，孵化后接种易感动物、鸡胚、细胞，以测定血清对病毒感染力的中和程度。1、稀释液：乳汉液、Hank,s液、维持液。2、病毒制剂：从感染动物分离的病毒必须在鸡胚、实验动物、细胞中连续通过几代，使其滴度稳定后，才能用于本试验。感染力不应太低。3、血清：在许多病毒感染的诊断中，常在患病急性期和康复期分别采血液，用已知病毒测定血清中和抗体的滴度。抗体滴度增高4倍以上，可认为疾病由该病毒引起。一、准备工作 血清使用前56灭活30min消除非特异性抑制物。4、病毒、血清混合液的处理：病毒与血清混合通常要37感作，使抗体与病毒充分混合。可根据病毒的特性采用更为适宜的处理方法。
26、有的病毒与血清混合不经培养，立即进行试验，效果也很好；有的病毒和血清混合376h再4过夜，此法为免疫灭活，能检出低水平的抗体。但大部分要37感作1h。5、实验系统：病毒与血清混合经培养后按病毒特征接种到易感的系统中，以检测混合液中未被中和的病毒的感染力。实验系统：鸡胚：此系统中血清的中和作用测定主要根据能否阻止鸡胚死亡、绒尿膜上的豆癍形成、病毒的血凝。实验动物：常用小鼠，观察死亡率、发病率。细胞：大多数在聚苯乙烯微量细胞培养板上进行微量中和试验。根据实验测定方法不同，中和试验可分为终点法、蚀斑减数法、交叉保护实验、动态法等4种类型。本试验以终点法中和试验为例：这是检查血清内中和抗体的最常用方法
27、。具体方法有两种，即固定病毒稀释血清法和固定血清稀释病毒法，其中以前一种方法更为常用。在此实验中病毒量不变而将血清作倍比连续稀释。此法常用于测定抗血清的滴度或疫苗的免疫原性。以新城疫为例在成纤维细胞上作中和试验。1、病毒：在细胞上滴定TCID50，用稀释液稀释病毒成200TCID50/20l。2、血清：待检血清和对照阴性血清灭活后按下表稀释。二、正式实验固定病毒稀释血清中和试验待检血清及阴性血清的稀释 试管号12345678 9 10 稀释液（ml）0.5 0.5 0.5 0.5 0.50.5 0.50.5 0.5 0.5血清量（ml）0.5 0.5 0.5 0.5 0.50.5 0.50.5
28、 0.5 0.5稀释倍数 2 4 816 3264128 256 512 10243、病毒-血清混合液：将病毒液0.5ml（200TCID50/20l）与不同的待检血清和阴性血清0.5ml分别混合，在37水浴中作用1h。4、接种细胞培养：将长成单层的细胞培养板倾去营养液，用Hanks液洗一次，接种病毒血清混合液20l（含病毒100TCID50），每一稀释度混合液接种4孔37吸附1h，补加维持液培养，每日检查CPE。当阴性血清的各管出现CPE时，既可读取结果。5、抗体滴度的计算：待检血清中和抗体滴度一般以抑制50%细胞培养孔的血清最高稀释度表示可按Reed-Muench法计算固定病毒稀释血清中和
29、试验计算方法 稀释度死亡比死活 累计 保护率死 活 死亡比1:4(10-0.6)0/404090/9100%1:16(10-1.2)1/413151/683%1:64(10-1.8)2/422323/540%1:256(10-2.4)4/440707/701:1024(10-3)4/44011 011/70 按Reed-Muench法计算，能保护50%细胞的血清稀释度介于10-1.2和10-1.8之间，距离比83-5083-400.77公式：高于50%保护率血清稀释度的对数距离比稀释系数的对数（-1.2）0.77（-0.6）-1.66待检血清的50%中和效价为10-1.661/45，即将血清作
30、45倍稀释可以保护50%的细胞免于感染、死亡、出现病变。此种方法是在固定量的血清中，加入等量的不同稀释度的病毒，用对照非免疫血清和待检血清同时进行测定，计算每一组的TCID50，然后计算中和指数。中和指数固定血清稀释病毒中和试验实验组TCID50对照组TCID50固定血清稀释病毒法计算中和指数病毒稀释度10-1 10-210-310-410-510-610-7TCID50对照血清组 4/44/4 4/4 4/4 3/4 1/4 0/4 10-5.5待检血清组 4/42/4 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 10-2.2实验组TCTID50对照组TCID50中和指数10-5.5/10-2.2103.31995 该结果说明待检血清中和病毒的能力是对照血清的1995倍。通常，待检血清的中和指数大于50者，即可判为阳性；10-49为可疑；小于10为阴性。
