1、1.2 基因工程的基本操作程序 补：原核细胞的基因结构 非编码区非编码区编码区 与RNA聚合酶结合位点 启动子终止子 RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点， 并与其结合。 转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并 以DNA分子的一条链为模板合成RNA。 转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚 合酶也从DNA模板链上脱落下来。 补：真核细胞的基因结构 编码区非编码区非编码区 与RNA聚合酶 结合位点 内含子 外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内 含子 启动子 终止子 内含子： 外显子： 真核 细胞 的 基因 结构 编码区 非编码区 外显子：能编码蛋白
2、质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列 ：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点。 非编码序列：包括非编码区和内含子 原核细胞真核细胞 不同点 编码区是 _的 编码区是间隔的 、_的 相同点 都由能够编码蛋白质的_和具 有调控作用的_区组成的 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 思 考 编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核 细胞与真核细胞基因结构一样长吗？ 连续不连续 编码区 非编码 基因工程基本操作的四个步骤 1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定 一、目的基因的获取一、目的基因的获取 1、目的基因主要是指_
3、编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因 请举出三个以上的例子 2、获取目的基因的常用方法有哪些? （1）从基因文库中获取 （2）利用PCR技术扩增(PCR仪) （3）人工合成（DNA合成仪 ） 目的基因是人们所需要转移或改造的基因目的基因是人们所需要转移或改造的基因, , 获取目的基因是实施基因工程的第一步获取目的基因是实施基因工程的第一步 。 如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物 的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋 白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因 等。等。 (
4、一)从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多 DNA片断，导入到受体菌的群体中，各 个受体菌分别含有这种生物的不同基因 ，称为基因文库 基因文库基因文库 基因组文库基因组文库 部分基因文库部分基因文库 （如（如: :cDNAcDNA文库）文库） 1.基因文库 基因组基因组 文库与文库与 部分基部分基 因文库因文库 的关系的关系 2.基因组组 文库的构建 供体细胞中的供体细胞中的DNADNA 许多许多DNADNA片段片段 运载体运载体 限制酶限制酶 与载体连接与载体连接 受体细胞受体细胞 产生特定性状产生特定性状 导入导入 外源外源DNADNA扩增扩增 目的基因 分离 用限制酶 切
5、断成许多 片段 反转录法反转录法 目的基因目的基因 的的mRNAmRNA 含目的含目的 基因基因 mRNA很不稳定，要 求的技术条件较高 3.cDNA 文库的构建 哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？ 1 1）DNADNA自动测序仪：自动测序仪： 2 2）PCRPCR技术技术： 对提取出来的基因进对提取出来的基因进 行核苷酸序列分析。行核苷酸序列分析。 使目的基因的片段使目的基因的片段 在短时间内成百万倍在短时间内成百万倍 地扩增。地扩增。 PCRPCR 技技 术术 扩扩 增增 目目 的的 基基 因因 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核
6、酸合成技术 条件：_、 _、_ (做启动子)、 _.前提条件： 原理：_ 方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数） 结果： 聚合酶链式反应 体外特定DNA片段 DNA复制 已知基因的核苷酸序列 四种脱氧核苷酸一对引物 DNA聚合酶 指数2n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 ( (二二) )利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 过程： a、DNA变性（95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_ b、退火（复性55）：系统温度降低，引物与 DNA模板结合，形成局部_。 c、延伸（72）：在Taq酶的作用下，从 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的_。 氢
7、键单链DNA 双链 DNA链 ( (三三) )直接人工合成直接人工合成 通过DNA合成仪用化 学方法直接人工合成 DNADNA合成仪合成仪 根据已知的结构基根据已知的结构基 因的核苷酸序列，再因的核苷酸序列，再 通过化学方法，以单通过化学方法，以单 核苷酸为原料直接合核苷酸为原料直接合 成目的基因。成目的基因。 仅限于合成核苷酸仅限于合成核苷酸 对较少的简单基因对较少的简单基因 n从基因文库中获取 n利用PCR技术扩增 n利用化学方法人工合成 一、目的基因的获取一、目的基因的获取 1.用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。 2.用_切断目 的基因，使其产生_ _。 3.将切下的目的
8、基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒） 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 的黏性末端 切口 DNA连接酶 相同 核心二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建 质粒质粒DNA分子 限制酶处理 一个切口一个切口 两个黏性末端两个黏性末端 两个切口 获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子 （重组质粒） 同一种 4.过程: 5.基因表达载体的组成： 复制原点复制原点、目的基因目的基因、启动子、终止子、标记基因启动子、终止子、标记基因 它们各有它们各有 什么作用什么作用 ? ? 基因表达载体的构建基因表达载体的构建 1 1）用一定的）用一定的限制酶切割质粒限
9、制酶切割质粒，使其出现，使其出现一一 个切口个切口，露出，露出黏性末端黏性末端。 2 2）用限制酶）用限制酶切断目的基因切断目的基因，使其产生，使其产生相同相同 的的黏性末端黏性末端。 3 3）将切下的目的基因片段）将切下的目的基因片段插入质粒插入质粒的切口的切口 处，再加入适量处，再加入适量DNADNA连接酶连接酶，形成了一个，形成了一个重重 组组DNADNA分子分子（重组质粒）（重组质粒） 目的基因与运载体的结合过程，实际目的基因与运载体的结合过程，实际 上是不同来源的上是不同来源的基因重组基因重组的过程的过程。 转化 方法 将目的基因导入 植物植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基
10、因导入 微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射法 感受态细胞 目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程 受体细胞 稳定表达 三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞 1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法农杆菌转化法 （1 1）农杆菌介绍）农杆菌介绍 （2 2）原理及适用范围）原理及适用范围 2、将目的基因导入动物细胞 （1）方法：显微注射法 （2）程序： 3、将目的基因导入微生物细胞 （1）思考：为什么选用微生物作为受体细胞？ （2）方法： 受体细胞为受精卵 Ca2+ 感受态细胞 1 1）将细菌用）将细菌
11、用CaClCaCl 2 2 处理处理，以，以增大增大细菌细菌细细 胞壁的通透性胞壁的通透性。 2 2）使含有目的基因的）使含有目的基因的重组质粒进入重组质粒进入受体受体 细胞。细胞。 3 3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而 复制复制，由于细菌，由于细菌繁殖的速度繁殖的速度非常快，在很非常快，在很 短的时间内就能获得短的时间内就能获得大量大量的目的基因。的目的基因。 将目的基因导入微生物将目的基因导入微生物 受体细胞中真正摄入了受体细胞中真正摄入了含目的基因含目的基因的的重组质粒重组质粒很少，很少， 必须将它从中检测出来。利用必须将它从中检测出来。利用标记基因
12、（抗生素抗性基标记基因（抗生素抗性基 因）因）进行筛选。过程如下：进行筛选。过程如下： 1.1.选择选择不含标记基因不含标记基因的大肠的大肠 杆菌，并用杆菌，并用CaCa2+ 2+处理 处理受体细胞。 受体细胞。 2.2.将将“重组质粒重组质粒”与上述大肠杆菌与上述大肠杆菌 在缓冲液中混合培养。在缓冲液中混合培养。 3.3.将每个受体细胞单独培养在将每个受体细胞单独培养在含抗生素含抗生素的培养基上，的培养基上， 有菌落出现则说明导入有菌落出现则说明导入“重组质粒重组质粒”成功。成功。 重组质粒的重组质粒的导入导入是否成功呢？是否成功呢？ 进一步检测菌落中是否有目的基因的进一步检测菌落中是否有目
13、的基因的” ”表达产物表达产物” ”。淘汰无。淘汰无 表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。 不能，受体细胞必须表现出特定的性状不能，受体细胞必须表现出特定的性状 ，才能说明目的基因完成了，才能说明目的基因完成了表达表达。 受体细胞摄入受体细胞摄入DNADNA分子后就说明目的基因完分子后就说明目的基因完 成了表达吗？成了表达吗？ 若若不能表达，不能表达， 要对抗虫基因要对抗虫基因 再进行再进行修饰修饰。 检测 鉴定 检测转基因生物染色体的染色体的DNADNA 上是否插入了目的基因 检测目的基因是否转录出了转录出了mRNAmRNA 检
14、测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫或抗病鉴定、功能活性鉴定 方法 方法 方法 DNA分子杂交 分子杂交 抗原抗体杂交 四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定 DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分 子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补 的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合 在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序 列的部位，仍然是两条游离的单链。 从人体中克隆出胰岛素基因的编码序列从人体中克隆出胰岛素基因的编码序列( (cDNAcDNA); ); 将将cDNAcDNA前接上在大肠杆菌质粒中，构建成一个表前接上在大肠杆菌质粒中，构建成一个表 达载体（含四环
15、素抗性基因）达载体（含四环素抗性基因）; ; 将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中, ,然然 后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌. .若表达若表达 载体未进入大肠杆菌载体未进入大肠杆菌, ,会因无抗四环素基因而死亡会因无抗四环素基因而死亡; ; 若培养基上长出大肠杆菌若培养基上长出大肠杆菌, ,说明胰岛素基因已进入说明胰岛素基因已进入 了大肠杆菌中了大肠杆菌中; ; 培养含有胰岛素基因的大肠杆菌培养含有胰岛素基因的大肠杆菌, ,收集菌体收集菌体, ,破碎破碎 后从中提取人的胰岛素后从中提取人的胰岛素. . 试叙述大肠
16、杆菌如何产生人的胰岛素过程？试叙述大肠杆菌如何产生人的胰岛素过程？ 1. 目的基因的获取 从基因文库中获取 (建库的方法：直接分离法、反转录法、根据已知氨基酸合成DNA法) 利用PCR技术扩增 化学方法人工合成 2. 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 3. 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法（植物）、显微注射技术（动物）、微生物 4. 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译 鉴定：抗性鉴定、功能活性鉴定 本节总结本节总结 1）以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷 酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是
17、：具有多 个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来 C 典型例题典型例题 2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA D D 3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶 A A 4）基因工程是在DNA分子水平上进行设计 施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行 碱基互补配对的步骤是 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合
18、C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达 C C 再生原理 D生态工程是生态学和工程学的结合 D BCD 15.（多选）下列关于生态工程的叙述，正确的是 A北京窦店村综合发展型生态工程建立了良好的能量多 级利用和物质的循环再生程序 B在城市环境治理中，实现垃圾分类处理体现了整体性 原理 C对湿地的恢复，只要注意退耕还湿地或建立自然保护 区就可以了 D. 我国的生态工程应该以经济效益和社会效益为主要目 标 AB 12.某地区的农民充分利用自然条件建立了特有的蔗基鱼 塘和桑基鱼塘。如下图，请根据此图回答： 这种人工生态系统最基本的生物因素 是_；要使它长期稳定发展，除了 有稳定的能量，
19、各类生物还要_。 建立这一生态系统的目的是使生产者固定的能 量_；其能量利用率高的原因是 其在营养结构上具有_的特点。 生产者和分解者 保持相对稳定 流向对人类最有益的方向 食物链短 蚕粪、蔗叶进入鱼塘经过_的作用又被桑和 蔗所利用。 概括地说，生态系统功能的维持取决于它的 _。 分解者 生产者、消费者和分解者之间的物质循环和能量 流动在较长时间内保持动态平衡 27下图是某中学研究性学习小组的同学在学习了生态 系统的知识后，设计的农业生态系统图解。请结合课本 知识回答有关问题 农业生态系统的主要功能_和_。 该生态系统的最大优点是 。 农业生态系统是一种人工生态系统，下列有关人工生 态系统的说法，正确的是（ ） A使废物资源化 B减少了化肥等工业产品的投入， 有利于保护环境 C抵抗力稳定性低于自然生态系统 D人占主导地位，是其它生物生存的基础 能量流动 物质循环 实现能量的多级利用和物质循环利用 ABC 农业生态系统中起决定作用的是_，各种生物 所利用的能量最终来源于_ 。 蘑菇和蚯蚓在该生态系统中属于_。 该系统设计是要遵循的生态学原理 是 。 农作物 光能 分解者 物质循环再生原理，物种多样性原理等
