1、上海科技教育出版社生物学普通高中教科书生物技术与工程选择性必修 3编写人员名单主 编 张新时 执行主编 张可柱 分册主编 何兴明 石 建编著者（以姓氏笔画为序）汤 洋 汪绍鑫 陈 亮 郑达钊赵广宇 唐志哲 梁江遊 彭小敏 熊 硕审 读 王仁卿 李文军“葡萄美酒夜光杯，欲饮琵琶马上催。”“兰陵美酒郁金香，玉碗盛来琥珀光。” 唐朝诗人这些充满豪情的诗句，说明唐代的酒文化已经相当发达。我国先民早在 4000 年前的龙山文化时期就掌握了发酵酿酒技术，至少在 3000年前的周朝，人们就已在利用微生物发酵制取酱、豉和醋。古老的酿造技术只能利用天然的发酵过程为人类服务，而现代生物技术与工程则可以按需改造现有
2、的生物，甚至创造出全新的生物类型。20 世纪 70 年代以后，发酵工程、细胞工程、基因工程等取得了突飞猛进的发展。例如，现代生物技术开始利用生物芯片等寻找致病基因，甚至能采取基因治疗手段，为根治疾病带来了希望；基因工程和细胞工程应用于农作物技术，能够带来抗虫害、 抗冻和改善作物品质等益处， 还能使高品质经济植物的产量得到极大提升；此外， 工业菌种发酵工程已替代了一些传统化工工艺， 开启新型绿色工业之门。现在，现代生物技术与工程已经广泛应用于工业、农牧业、医药、环保等方面，产生了巨大的经济效益和社会效益。但与此同时，现代生物技术与工程产生的伦理问题和安全问题，也给人类社会带来了前所未有的冲击和挑
3、战。本模块是高中生物学选择性必修 3生物技术与工程，包括发酵工程、细胞工程、基因工程以及现代生物技术安全与伦理。同学们通过学习，可加深对必修内容的理解，并在动手实践中了解生物技术与工程的基本原理、获得基本知识，同时理解必须在法律和伦理的约束下，以人类需求为目标进行产品开发，进而推动生物学不断进步，提高人类生活质量。为了大家更好地学习，这一模块精心设立了如下栏目：致 同 学 们章首页 精美的图片和富有深意的章引言，让同学们带着问题出发，逐步学习一章的主要内容；以时间轴形式呈现的科学史，一目了然地呈现与本章学习内容有关的重要科学发现。第三章 基因工程赋予生物新的遗传特性70第三章 基因工程赋予生物
4、新的遗传特性“炎黄子孙”是海内外华人引以为荣的自我称谓，炎帝和黄帝并称中华始祖，关于他们的神话传说很多。相传黄帝统一天下后，他看见一只带有五彩翎毛的大鸟在天空翱翔，数不清的奇珍异鸟围着它翩翩起舞，这就是我国家喻户晓的古代传说“百鸟朝凤”。据尔雅释鸟所记载，凤凰形体为“鸡头、蛇颈、燕颔、龟背、鱼尾、五彩色，高六尺许”。凤凰是祥瑞、和谐的象征，是华夏民族的精神图腾。虽然具有多种动物特征的凤凰只存在于传说之中 , 但是现在科学家运用基因工程技术，确实能将一种生物的基因转入另一种生物体内，并使后者表现出原本不具有的特殊性状。怎样才能实现基因在不同物种之间转移和表达？这种新技术将对生命世界带来哪些奇妙的
5、变化？百鸟朝凤图卷局部图 （清 沈铨）1956 年科恩伯格实现DNA 的体外复制1972 年伯格实现DNA 的体外重组1973 年科恩和博耶实现外源基因的复制和表达1978 年史密斯发明寡核苷酸定点诱变技术1983 年穆利斯发明聚合酶链式反应技术1983 年植物转基因技术取得重大进展1989 年卡佩奇等创立小鼠的基因打靶技术70阅读空间 提供一些趣味性的自主阅读资料，既与正文相呼应，又引领同学们将学习与生活实际密切联系。阅读空间视野拓展视野拓展 包括时代亮点、历史长河、榜样人物、科学生活和绿色视野等，展现与本章内容有关的最新研究进展，回顾重大历史发现，介绍榜样人物的高贵品质，为同学们提供更多的
6、学习意义启发。学业要求 聚焦生物学大概念，关注生物学学科核心素养，以表格的形式，简洁明了地将本章有关的课程标准内容要求和活动要求按一定逻辑呈现出来，有助于同学们将学习内容结构化联结， 以提升本章内容学习水平。学业要求思维训练 通过模型建构、曲线解读等形式，认识事物，探讨、阐释生命现象及其规律，进一步发展科学思维。思维训练课题研究课题研究 通过一个探究实验、调查研究活动或者模型制作活动等项目实现任务驱动，引领全章内容的学习。学业检测 每节正文之后，以核心素养为指向，围绕本节内容精心设计一组自评自测题，促进学习目标内化和巩固，便于同学们自我反馈、自我评价、主动发展。学业检测探究活动 通过实验探究、
7、资料探究、社会考察、经典再现、模型建构、方案设计、观点碰撞等形式引领同学们针对特定的主题进行观察提问、实验设计、方案实施、分析讨论，逐步增强对自然现象和社会现实的好奇心与求知欲，掌握科学探究的基本思路和方法，培养主动学习与思考的品质。探究活动第一章 发酵工程利用微生物进行规模化生产2课题研究尝试培养微生物 3第一节 无菌技术和制备培养基是培养微生物的基础 4 一、防止杂菌污染的技术 4 二、配制适合微生物生长繁殖的营养基质 6第二节 获取纯净的微生物培养物10 一、从微生物群体中分离出目标微生物10 二、培养特定微生物群体11第三节 测定微生物的数量16 一、间接计数法16 二、直接计数法20
8、第四节 发酵工程为人类提供多样的生物产品22 一、运用传统发酵技术生产食品22 二、利用发酵技术工业化生产产品25第二章 细胞工程通过细胞水平的操作获得产品32课题研究观察多肉植物的叶插繁殖过程33第一节 植物细胞工程包括组织培养和体细胞杂交等技术34 一、组织培养技术将外植体培育成新植株 34 二、体细胞杂交技术使两种细胞融合育出新植株40 三、植物细胞工程的应用提高了生产效率41第二节 动物细胞培养是动物细胞工程的基础44 一、动物细胞培养经历原代培养和传代培养44 二、动物细胞培养需要适宜的外部条件45目 录C O N T E N T S第三节 利用动物细胞融合技术可制备单克隆抗体50
9、一、细胞融合技术使不同细胞结合成一个细胞50 二、细胞融合技术是单克隆抗体制备的重要技术 51第四节 核移植和干细胞技术具有广阔的应用前景55 一、核移植技术可实现动物体细胞核的全能性55 二、干细胞技术的发展和应用58第五节 胚胎工程可处理早期胚胎获得目标个体62 一、胚胎形成经过了受精及早期发育等过程62 二、胚胎工程有广阔的应用前景65第三章 基因工程赋予生物新的遗传特性 70课题研究模拟DNA分子的剪切和拼接 71第一节 基因工程是一种重组 DNA 技术 72 一、生物科学与技术的发展催生了基因工程72 二、重组 DNA 技术需要三种基本工具 73 三、基因工程的基本操作程序74第二节
10、 基因工程的广泛应用改善了人类的生活品质80 一、基因工程赋予农作物新的优良性状80 二、基因工程在畜牧业、渔业上应用前景广阔 83 三、基因工程在医学领域贡献巨大84第三节 蛋白质工程是基因工程的延伸88 一、根据基因工程原理设计和改造蛋白质88 二、蛋白质工程可改变蛋白质的性状和功能91第四章 现代生物技术引发的安全与伦理思考96课题研究调查消费者对转基因产品的了解和接受程度97第一节 转基因产品的安全性引发广泛关注 98 一、转基因产品引发安全争议98 二、努力保障转基因产品的安全 100第二节 世界范围内应全面禁止生物武器 104 一、生物武器对人类造成威胁与伤害 104 二、生物武器
11、比常规武器更具危害性 105 三、针对生物武器的特点进行防护 107 四、我国反对生物武器及其技术和设备的扩散 108第三节 关注生物技术带来的伦理问题 110 一、生殖性克隆人引发伦理风波 110 二、我国禁止任何生殖性克隆人实验 112 三、其他生物技术也面临诸多伦理问题 113附录一 实验室规则116附录二 部分培养基配方117附录三 现场救护的基本原则119第一章 发酵工程利用微生物进行规模化生产 从繁华的都市到苍凉的沙漠，从生机勃勃的热带雨林到人迹罕至的北极冰川，从空气稀薄的高空到压力巨大的深海，从生物的体表到体内，处处都有微生物的踪迹。这些人类肉眼看不见的生命在地球的物质循环和能量
12、流动中，起着不可或缺的作用。人类文明发展的历史也与微生物息息相关，人们利用微生物获得酒、醋、面包等食物以及抗生素等多种药物，同时微生物也给人类带来麻烦甚至灾难。显微镜的问世，开启了人类认知微生物世界的大门，巴斯德（L. Pasteur）的实验奠定了现代微生物学的基础，使人类逐步认识并利用微生物。如今，微生物学与现代工程技术相结合发展为发酵工程，使传统发酵技术迈上了一个新的台阶，在修复环境、开发新能源和保障人类健康等方面发挥着无可替代的作用。那么，如何在实验室培养出所需的微生物？如何利用这些微生物的特定功能，规模化生产出对人类有用的产品呢？约公元前 6000 年早期酿酒工艺出现公元 533544
13、 年贾思勰著齐民要术公元 640 年马奶葡萄和葡萄酒酿制技术传入中原地区18571885 年巴斯德创立细菌学说1872 年 科 恩细菌研究出版1982 年沃伦和马歇尔发现幽门螺杆菌可致胃病21. 以表格、照片和观察日志等方式展示实验结果。2. 请教老师或专业人员，初步鉴定所培养微生物的种类。3. 比较来自不同环境中的微生物，其种类是否有差异。课题研究提出问题制订并实施研究计划成果交流 确定获取微生物的场所（如土壤、空气等）。 设计恰当的方法，将环境中的微生物转移至“皮冻”。 将含有微生物的 “皮冻” 放置在适宜的环境中， 持续一定时间。2. 怎样获取环境中的微生物？ 查阅培养微生物的营养基质的
14、种类。 查阅营养基质“皮冻”的制作方法。 购买相关材料自制“皮冻”。1. 怎样制作营养基质？图 1-1 “皮冻”上的微生物群体怎样制作营养基质，培养出肉眼可见的微生物群体？尝试培养微生物从居住在人体肠道内，能为人类提供多种营养物质的益生菌群，到环伺在人体周围，随时会侵入人体兴风作浪的有害微生物，人们天天都在和微生物打交道。但由于微生物个体实在太小，人们往往无法感知它们的存在 , 只有借助显微镜才能目睹其真容。如果一个或几个微生物通过繁殖形成的成千上万甚至数百万个微生物聚集在一起，就能成为肉眼可见的“庞大”群体，便于人们开展研究。 查阅资料，明确判断微生物群体特征的方法。 观察“皮冻”表面是否出
15、现微生物。 如果出现微生物，观察其中微生物群体的特点。 依据微生物的群体特征，设计表格进行记录。3. 如何进行观察记录 ?3第一章 发酵工程利用微生物进行规模化生产4100 多年前，伤口感染曾是外科医生面临的难题之一。如今，为防止病人在手术时被病菌感染，手术前需要对手术室进行灭菌和消毒，手术中使用的各种手术器械、用品也必须经过灭菌处理， 连病人和医生也要进行消毒 （图1-2） 。那么，除了医疗卫生领域外，还有哪些领域需要进行灭菌和消毒呢？人们是如何进行灭菌和消毒的？ 一、防止杂菌污染的技术微生物（microorganism）是肉眼看不见或者看不清的微小生物的总称，包括病毒、细菌、放线菌、真菌等
16、。在自然环境中，微生物种类繁多、分布广泛。它们可以通过多种方式传播到生物体或者食物等基质上。如果要创造一个没有外来杂菌干扰的环境，就需要通过灭菌和消毒等技术来消除这些微生物。在微生物研究、医疗操作、食品生产中采取的防止其他微生物污染的技术， 就是无菌技术 （aseptic technique）。 灭菌方法灭菌（sterilization）是指用强烈的理化因素杀死环境或物体内外所有的微生物，使微生物永远丧失其生长繁殖能力，常用的是高温灭菌法、紫外线灭菌法等物理灭菌法。在微生物培养中，针对不同的实验用品需采用不同的灭菌方法。最常用的是高压蒸汽灭菌法（high pressure steam ster
17、ilization），将待灭菌的物品放入高压蒸汽灭菌锅（图 1-3）中，通过加热使蒸汽压达到0.1MPa、 温度为121时，维持 2030min，即可达到灭菌目的，此法适用于培养基、无菌水、工作服、玻璃器皿等物品的灭菌。培养皿等玻璃器皿也可采用在 160180的灭菌烘箱中放置 2h，利用热空气进行灭菌；图 1-2 手术前的消毒图 1-3 高压蒸汽灭菌锅第一节 无菌技术和制备培养基是培养微生物的基础5第一节 无菌技术和制备培养基是培养微生物的基础像接种环、接种针、镊子等金属用具，以及玻璃试管口、瓶口等适用于火焰灼烧灭菌。热空气灭菌、灼烧灭菌均属于干热灭菌法（dry heat sterilizat
18、ion）。高压蒸汽灭菌法和干热灭菌法都是利用高温使微生物细胞内的蛋白质等活性物质变性，从而使微生物丧失活性，达到灭菌的目的。针对无菌室和超净工作台等物体表面的灭菌，通常采用紫外线灭菌法（ultraviolet sterilization）。消毒方法 消毒（disinfection）是指用化学、物理、生物等方法消除或杀灭外界环境中的致病微生物的措施。煮沸消毒法是最常用的消毒方法，它是针对某些实验器具、餐具、饮用水等，采用在 100煮沸 510min 的方法，达到消毒的目的。巴氏消毒法是指利用低于 100的热力杀灭微生物的湿热消毒方法，广泛应用于牛奶、啤酒、人乳及婴儿合成食物等不能进行高温灭菌的液
19、体的消毒。例如，将牛奶在 6265下维持 30min 消毒，可保证牛奶食用安全，且不失原本风味。还有化学药剂消毒法，如采用碘酒、 体积分数为70%的酒精、 双氧水、 来苏尔等化学药剂，对实验室的空间、操作台表面、实验人员的工作服与手等进行消毒。防 腐在微生物的研究和应用中，控制有害微生物的措施除了灭菌、消毒外，还有防腐。防腐是利用某种理化因素完全抑制微生物的生长、繁殖，以防止食品、生物制品等发生腐败的措施。防腐的方法很多，原理有所不同。1. 低温：利用 4以下的低温保存食物、生化试剂、生物制品、菌种等。2.缺氧：利用抽真空、 充氮或二氧化碳等方法， 防止食品、 粮食等变质， 达到保鲜的目的。3
20、. 干燥：采用晒干、烘干等干燥方法对粮食、食品等进行干燥保藏。4. 高渗：通过盐腌和糖渍等高渗措施保存食物。5. 高酸度：利用乳酸菌发酵产生乳酸，借助其酸度达到抑制杂菌、防止腐败变质的目的。6. 高醇度：利用白酒、黄酒保存食品。7. 防腐剂：在需要保存的对象中，加入适量的苯甲酸、乙二酸、山梨酸等防腐剂，以达到防止腐败变质的目的。阅读空间第一章 发酵工程利用微生物进行规模化生产6实验探究配制培养基由于不同微生物的营养方式存在差异、实验研究的目的不尽相同，实验室配制的培养基营养成分、物理状态是不一样的。尽管配制的培养基类型不同，但是，配制的基本方法和操作步骤是基本相同的。目的要求1. 运用培养基配
21、制的原理与方法，配制马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，为酵母菌的纯化培养做准备。2. 使用不同的无菌技术，完成培养基配制。材料器具 去皮马铃薯、葡萄糖、琼脂、蒸馏水，滤纸、天平、药匙、纱布、量筒、搪瓷杯、玻璃棒、电磁炉、锥形瓶、棉塞、高压蒸汽灭菌锅、酒精灯、培养皿。活动程序1. 配制培养基原料称量、溶解 根据培养基的配方，准确称取各原料成分（图 1-4 ）并置于搪瓷杯中，加入适量蒸馏水，在电磁炉上边加热边搅拌（图 1-4 ），以防琼脂糊底或溢出，直至琼脂完全溶解，然后加蒸馏水至 1000mL（PDA 培养基的原料称量、溶解步骤见附录二）。调节 pH 配制培养基时，需要根据微生物的类群调节 pH
22、。一般来说 , 细菌适合于中性环境，放线菌适合于偏碱性环境，而酵母菌和霉菌适合于微酸性环境。先用精密 pH 试纸测定培养基的原始 pH，再滴加 1mol/L 的 NaOH 或盐酸溶液，边滴加边搅拌，并随时用 pH 试纸测试，直至达到所需 pH。分装、包扎 将配制好的培养基分装到锥形瓶内（不超过其容积一半为宜）；用棉塞塞紧，棉塞外包一层牛皮纸或旧报纸（图 1-4 ）。用记号笔注明名称、组别、日期。 二、配制适合微生物生长繁殖的营养基质微生物需要从生活环境中获取各种营养物质，以维持自身的生命活动。微生物代谢方式不同，因而对营养物质的需求也有差异。在培养微生物时，可根据微生物生长繁殖和代谢的需要，将
23、各种营养物质混合在一起，配制成适合微生物生长、繁殖和产生代谢产物的营养基质培养基（culture medium）。7灭菌 将洗净晾干的培养皿，用旧报纸进行包扎，每包 610 套，与配制的培养基一起放置于高压蒸汽灭菌锅中，121灭菌 20min。2. 倒平板倒平板前，实验操作人员先洗手，再用体积分数为 70% 的酒精消毒。用紫外线照射无菌室或者超净工作台，灭菌 2030min，或用 70% 的酒精擦拭超净工作台表面。 倒平板的全过程需要在酒精灯火焰旁的无菌区进行操作。待培养基冷却至 50左右时，右手持装有培养基的锥形瓶，在酒精灯火焰旁拔出棉塞（图 1-4 ）。 右手拿锥形瓶，瓶口通过火焰，灼烧灭
24、菌（图 1-4 ）。左手持培养皿，将皿盖打开一条缝。右手将锥形瓶中的培养基约 15mL 倒入培养皿（图1-4 ）。立即盖上培养皿盖，待培养基冷却至凝固后，倒置平板备用。 称量 溶解 分装 拔出棉塞 灼烧灭菌 倒平板图 1-4 制备培养基分析讨论 1. 培养基配制后为什么要立即进行灭菌？2. 已灭菌的培养基如何进行无菌检查？3. 灭菌后制成的培养基为什么要及时使用？第一节 无菌技术和制备培养基是培养微生物的基础第一章 发酵工程利用微生物进行规模化生产8微生物的营养要素主要作用碳源（carbon source）能够提供微生物生长繁殖所需碳元素的营养来源。氮源（nitrogen source）能够提
25、供微生物生长繁殖所需氮元素的营养来源。能源（energy source）能够为微生物生命活动提供最初能量来源的营养物质。生长因子（growth factor）对调节微生物正常代谢必需的、不能用简单的碳源和氮源自行合成的微量有机物，如维生素、含氮碱基等。无机盐（mineral salts）为微生物提供除碳源、氮源以外的其他各种重要元素。水微生物最基本的营养要素，在微生物生存中起重要作用。配制培养基时，除满足微生物所需的营养物质外，还要有适宜的 pH 和渗透压。同时，还要根据研究目的的差异，配制不同物理状态的培养基。培养基按照其物理状态划分， 可分为液体培养基 （liquid medium）、固体
26、培养基（solid medium）、半固体培养基（semi-solid medium）。其中，固体培养基是将含有琼脂等凝固剂的培养基基质溶解、冷却后制成的凝固状态的培养基。 在无菌培养皿中制成的固体培养基， 也称为平板培养基。从外界环境中获取营养物质是微生物的重要生理特征，科学配制培养基以适合培养特定微生物的需要，是进行微生物研究的基础。而无菌操作技术可防止其他微生物的污染，使培养单一种类的微生物成为可能，是开展微生物研究的保障。学业检测1. 大肠杆菌结构简单、繁殖迅速，是生物学研究中的重要实验材料。在实验室中常使用牛肉膏蛋白胨培养基培养大肠杆菌，牛肉膏主要含有多肽、氨基酸、核苷酸、无机盐、维
27、生素等成分，蛋白胨则含有多肽、氨基酸等成分。（1）根据牛肉膏和蛋白胨的成分分析，二者为细菌的生长和增殖提供的营养要素主要有 _；如果需要配制固体培养基，还需要加入的物质是表 1-1 培养基中所含的微生物营养要素及其主要作用实验室培养的微生物需要从培养基中获得各种必需的营养物质，培养基的营养成分通常包括 6 种营养要素（表1-2）。9_。（2）配制培养基的主要操作步骤有 _。（3）无菌技术是培养微生物的基础，下列的无菌操作措施不恰当的是（ ）。 A. 需要对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行灭菌 B. 灼烧、高压蒸汽灭菌、紫外线照射等都属于无菌技术 C. 为避免环境中微生物污染，实验操作应在酒
28、精灯火焰附近进行 D. 实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触2. 法国微生物学家巴斯德在解决葡萄酒变酸的问题中，发明了巴氏消毒法，这种消毒方法已被广泛运用于牛奶、啤酒等不宜进行高温灭菌的食品生产，既延长了保存时间，又能保持食物风味。请根据所学内容，尝试回答下列问题：（1）为了筛选出使酒变酸的微生物，需要制备培养基。培养基的配制需要遵循相关原则和操作规范，下列叙述不符合要求的是（ ）。 A. 配制的培养基用干热灭菌法灭菌 B. 培养基配制需要适宜的渗透压和 pH C. 溶解琼脂需用玻璃棒不断搅拌以防糊底 D. 倒平板后需等待培养基凝固后将其倒置（2） 市售的牛奶中有部分是采用巴
29、氏消毒法杀菌的，通常称为“巴氏杀菌乳”（如右图）。这种牛奶一般来说储存时间较短， 其原因是什么？3. 我们生活的环境中有很多微生物存在，有些微生物可能使人患病。为防止疾病传播和交叉感染，公共场所和家庭中常会采取一定措施进行消毒或灭菌。请列举公共场所和家庭中常见的消毒或灭菌的方法，并尝试解释这些措施的原理。第一节 无菌技术和制备培养基是培养微生物的基础第一章 发酵工程利用微生物进行规模化生产10一直以来，幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，图 1-5）感染是慢性胃炎、消化性胃溃疡的主要病因。世界卫生组织报告，截至 2017 年，全球至少 37.5 亿人被感染，中国感染率超过 50
30、%。幽门螺杆菌发现于 20 世纪 80 年代初。当时，澳大利亚学者沃伦（R. Warren）发现，取自慢性胃炎和消化性胃溃疡病人体内的活检标本中有不知名的细菌。年轻医生马歇尔（B. Marshall）不断摸索培养条件，终于在培养基上培养出该细菌，这就是幽门螺杆菌。他们的发现，为研究和治疗胃部疾病提供了重要线索。幽门螺杆菌的发现过程运用了哪些微生物实验技术？研究人员又是如何判断生长在培养基上的微生物种类的？ 一、从微生物群体中分离出目标微生物微生物在自然界中往往是混杂生活在一起的，要想研究或者是利用某种微生物，就需要采用技术手段将目标微生物从中分离出来，以获得纯种微生物。从同种微生物群体中或者从
31、混杂的微生物群体中，获得某一种或某一株微生物的过程，称为分离纯化。分离微生物的技术，一是利用稀释的原理，即在平板培养基上，通过稀释涂布平板法（spread plate method）或平板划线法（streak plate method）等接种技术，在固体表面高度稀释微生物群体，使单位面积仅存留单个细胞，并使此单细胞增殖为一个新的群体，得到目标微生物的菌落；二是利用选择培养的原理，即选用仅适合目标微生物生长繁殖的特殊培养条件，培养混杂菌群，从中获取目标微生物的菌落，以达到分离的目的。图 1-5 幽门螺杆菌2m第二节 获取纯净的微生物培养物11菌 落在固体平板培养基上，单个微生物细胞或孢子可生长繁
32、殖成一个具有特定形状、肉眼可见的子细胞群体，称为菌落（colony）。在一定培养条件下，微生物的菌落形状、大小、边缘、隆起度和颜色等特征是稳定的（图 1-6）。如细菌菌落光滑，易与基质脱离；放线菌菌落质地致密，菌落较小而不致广泛延伸；酵母菌菌落较细菌菌落大而厚；霉菌形成的菌落较疏松，多呈绒毛状、絮状。通过对菌落特征的观察可以识别微生物的类群。阅读空间图 1-6 不同的菌落形态示意图 二、培养特定微生物群体分离得到的目标微生物，可用进一步用稀释涂布平板法或平板划线法等进行纯化，得到由单一微生物个体经过生长繁殖形成的群体。微生物的分离与纯化技术是探索微生物世界的重要手段。实验探究酵母菌的纯化酵母菌
33、（yeast）是单细胞真菌，现在已知有 1000 多种，常用作生物工程和细胞周期研究的模式生物。运用平板划线的方法，将酵母菌接种到 PDA 培养基上，可得到酵母菌的菌落。第二节 获取纯净的微生物培养物第一章 发酵工程利用微生物进行规模化生产12目的要求1. 运用平板划线法进行微生物的接种。2. 使用干热灭菌法等技术完成无菌操作。3. 观察酵母菌的菌落特征。材料器具酵母菌菌液，PDA 培养基（附录二），超净工作台或无菌箱、酒精灯、接种环、恒温培养箱等。 活动程序1. 接种接种（inoculation）是指无菌条件下，将纯种微生物或含菌材料转移到适合其生长繁殖的培养基中的过程。实验中要根据实验目的
34、、培养基种类和实验器皿的差异，采用不同的接种方法。在平板培养基上常用的接种方法有平板划线法、稀释涂布平板法等。（1）接种前的准备工作将所用的实验器材全部放入超净工作台（图 1-7）或无菌箱，用紫外灯照射 30min。进入无菌室前，要用消毒液清洁双手，还需换好工作服、鞋、帽，戴上口罩。（2）平板划线法接种将接种环的环端在酒精灯外焰上烧红，再将接种环斜放，沿环向上，烧至可能碰到培养皿的部分，来回数次（图 1-8）。在酒精灯火焰附近冷却接种环。左手拿取装有菌液的试管，让试管口缓缓通过火焰灭菌（图 1-9）。图 1-7 超净工作台图 1-8 灼烧接种环图 1-9 试管口通过火焰将接种环伸入试管内，蘸取
35、一环菌液（图 1-10）。左手持培养皿并开启一条缝隙，右手迅速将接种环伸入培养皿，在平板表面划线（图 1-11）。13划线的方法包括连续划线法和分区划线法。 连续划线法是从平板边缘的一点开始，连续作紧密的波浪式划线（图 1-12）。分区划线法是从平板的一边作第一次划线若干条，接着转动培养皿约 60 ，将接种环在火上灼烧并冷却后，通过第一次划线部分，作第二次划线。同法进行第三次、第四次划线（图 1-13）。通过平板划线，聚集的微生物被分散到培养基的表面。在数次划线后，可以分离得到由单个微生物细胞繁殖而来的菌落。 图 1-10 沾取菌液图 1-11 划线接种图 1-12 连续划线示意图图 1-13
36、 分区划线示意图2. 培养培养（cultivation）是指微生物被接种到培养基后，在一定条件下生长繁殖的过程。一般是将接种后的培养基放入恒温培养箱中（图 1-14），在适宜的温度下培养一定时间，以得到目标微生物。划线接种完毕后，盖上培养皿盖，做好标记。将培养皿倒置，放入 2830的恒温培养箱中，培养 35d。图 1-14 恒温培养箱第二节 获取纯净的微生物培养物第一章 发酵工程利用微生物进行规模化生产143. 观察记录观察酵母菌菌落特征并记录（图 1-15）。观察后，如果发现有杂菌，可进一步挑菌划线，完成纯化。图 1-15 划线法接种后获得的酵母菌菌落4. 纯培养挑取单个酵母菌菌落接种到培养
37、基上，在 2830 恒温培养箱中培养 35d，可获得纯净的酵母菌培养物。像这样获取由一个细胞或一群相同的细胞经过生长繁殖形成后代的过程，称为纯培养（pure cultivation）。分析讨论1. 同学之间比较划线分离的效果，分析出现划线效果差异的原因。2. 在本次活动中，你是否实现目标微生物的分离与纯培养？能否通过观察菌落特征判断微生物的类群？3. 你在实验中获得的目标微生物的纯净培养物，如果需要保留至以后使用，应该如何保存？如果不需要保留，应该如何处理？思维训练设计表格，记录现象我们的手上、手机屏幕上有多种微生物。结合前面所学，将微生物培养成菌落。观察获得的微生物菌落特征，包括菌落的大小、
38、 颜色、 形态和边缘等方面。 例如， 红酵母菌菌落 （图1-16）大小适中，颜色多为暗红色，形状为较规则的圆形，表面光滑，边缘整齐。将观察结果记录在自主设计的表格上，并根据菌落特征区分不同的微生物。图 1-16 红酵母菌菌落15琼脂平板培养基分离纯化技术是一种简便有效的微生物学常规技术，它至今仍广泛应用于微生物菌种的筛选、鉴定、育种、计数等工作中。分离纯化技术还在不断发展完善， 如许多用于活菌计数的平板等已日趋微型化、 简便化、商品化和系列化。学业检测1. 在微生物学的研究中，为了获取纯净的目标微生物，需要实施配制培养基、消毒灭菌、分离纯化等技术操作。请完善下面相关的实验操作步骤：（1）防止杂
39、菌入侵、获取纯净的培养基是研究和应用微生物的前提。对微生物培养基进行灭菌，一般采用 _ 法。在培养过程中，需要随机取若干灭菌后的空平板先行培养一段时间，这样做的目的是 _。（2）在平板培养基上，由 _ 生长繁殖成一个具有特定形状、肉眼可见的子细胞群体，称为菌落。在一定培养条件下，区分微生物种类可以依据菌落的_ 等特征。（3）采用平板划线法分离微生物时，接种环需要 灭菌。在第二次及以后划线时，总是从 _ 开始划线，这样做的目的是 _ 。2. 有机农药苯磺隆是一种除草剂，长期使用会污染环境。研究发现，苯磺隆能被土壤中某些微生物降解。分离降解苯磺隆的菌株的实验过程如图甲所示。 （1）微生物生长繁殖所
40、需要的主要营养物质有碳源、水、 _ 六类。（2）纯化菌株时，通常使用的划线工具是 _。划线的某个平板培养后，第一划线区域不间断地长满了菌落，第二划线区域所划的第一条线上无菌落，其他划线上均有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误有_。（3）有人认为某细菌能降解苯磺隆的原因可能是该菌能分泌降解苯磺隆的酶所致，为了检验该假设，研究人员将该菌的培养液过滤离心，取上清液做图乙所示的实验。该实验设计是否合理？为什么？第二节 获取纯净的微生物培养物第一章 发酵工程利用微生物进行规模化生产16在日常生活中，人们往往通过目测色泽、鼻闻气味、口尝味道等方法，判断食品是否变质，这样的判断方法可靠吗？在中华人民共和国食
41、品安全法制定的相关食品卫生强制性标准中，检测的指标包括了感官指标、微生物指标及理化指标等。 其中， 微生物指标中制定了对菌落总数、大肠菌群及其他致病性微生物的检测标准 （图1-17） 。 那么，食品中的微生物数量是如何测定的？ 一、间接计数法细菌、酵母菌等微生物的计数是测定其在单细胞状态下的个体数目，测定方法可分为两类：间接计数法和直接计数法。间接计数法中最常用的是稀释涂布平板计数法，该方法是根据微生物的单个个体可培养形成一个菌落的培养特征而设计的。用稀释涂布平板法计数时，需要将待测样品配制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开。再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀
42、分布于培养基表面；或将一定量的稀释液，与熔化后冷却至 45左右的琼脂培养基混合，倾入无菌培养皿中，摇匀、静置待凝。经过培养后，单个微生物生长繁殖形成菌落，一个菌落就代表着原稀释液中一个微生物个体。统计培养基中的菌落数，即可推算出检测样品中的活菌数。图 1-17 巴氏杀菌乳含菌量国家标准实验探究分离土壤中分解尿素的细菌并计数土壤中生活的微生物种类极其丰富且数量众多，它们对提高土壤肥力有重要作用。因此，土壤中相关微生物的数量可以作为判定土壤肥力的一个重要指标。用稀释涂布平板法将土壤稀释液接种到选择培养基上，得到分解尿素的细菌菌落，统计菌落数目，可计算得出土壤样品中细菌数量。项目采样方案及限量（若非
43、指定，均以 CFU/g 或 CFU/mL 表示）ncmM菌落总数5250 000100 000大肠菌群5215金黄色葡萄球菌500/25g（mL）-沙门氏菌500/25g（mL）-第三节 测定微生物的数量17第三节 测定微生物的数量目的要求1. 配制分解尿素的细菌的选择培养基。2. 配制系列浓度的土壤稀释液。3. 尝试采用稀释涂布平板法接种。4. 运用稀释涂布平板法对菌落进行计数。材料器具土壤样品，无菌水、分解尿素细菌培养基（附录二），培养皿、移液管、天平、锥形瓶、玻璃珠、涂布器、试管、高压蒸汽灭菌锅、酒精灯、恒温培养箱等。活动程序1. 制备土壤稀释液取土壤表层 510cm 处的土样。准确称取
44、 1g 土样，放入盛有 99mL 无菌水的锥形瓶（250mL，放有小玻璃珠）中，用手或摇床振荡 20min，即制成 102倍的稀释液。用 1mL 无菌移液管，吸取 102倍稀释液 0.5mL，移入装有 4.5mL 无菌水的试管中，配制成103倍稀释液。 用同样的方法可制成稀释倍数为104、 105、 106的系列稀释菌液 （图1-18） 。图 1-18 稀释涂布平板示意图第一章 发酵工程利用微生物进行规模化生产18移液时，要将移液管插入液面，吹吸 3 次，每次吸上的液面要高于前一次，让菌液混合均匀并减少稀释中的误差。2. 准备平板培养基并编号将已灭菌的培养基倒平板，制成平板培养基。将培养皿编号
45、，并在培养皿底部标出稀释倍数（依次为 104、105、106），每个稀释倍数设置 3 个重复（图 1-18）。3. 涂布平板用无菌移液管 3 支，分别吸取稀释倍数为 104、105、106的土壤稀释液各 0.2mL，滴到相应编号的培养皿中的平板培养基上（图 1-19）, 每个稀释倍数各 3 个培养皿。再分别用无菌涂布器将菌液涂布在平板上，涂布时可转动培养皿，使涂布均匀（图1-20）。4. 培养将上述接种好的平板培养基倒置，放入 2530的恒温培养箱中培养 2436h，直至长出菌落。 5. 观察记录将实验中得到的菌落数填入表 1-2。分析讨论1. 选取具有合适菌落数的稀释倍数并计数。在计算结果时
46、，从接种的 3 个稀释度中选择一个合适稀释倍数，统计出菌落数。选择的原则是：图 1-19 滴加菌液图 1-20 涂布器涂布稀释倍数104105106菌落数123平均123平均123平均表 1-2 不同稀释倍数下的菌落数19（1）细菌、放线菌、酵母菌以每个培养皿内有 30300 个菌落为宜。霉菌以每个培养皿内有 10100 个菌落为宜。如果菌落数大于该上限，计数会偏小。（2）同一稀释倍数各个重复的菌落数相差不要太悬殊。2. 将统计出的菌落数按下列公式计算，得出每克样品中的活菌数： 每克土壤样品活菌数 = 稀释倍数某稀释倍数的菌落平均数细菌培养时所用的稀释液体积当需要分离的微生物在混合样品中数量很
47、少时，通常采用选择培养基，选择性分离和培养目标微生物，使分离对象大量繁殖，便于计数。例如，分离可分解尿素的细菌的培养基中，只加入尿素作为唯一的氮源，使能分解尿素的细菌可以繁殖，其他微生物由于缺乏尿素分解酶，不能利用尿素作为氮源而无法生长，从而可以分离出能分解尿素的细菌。这种能让特定的微生物生长，抑制其他微生物生长，将所需要的微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基，就称为选择培养基（selective medium）。很多微生物都可以通过选择培养基进行分离纯化。配制选择培养基时，可以根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求，加入某些物质或除去某些营养物质（如碳源、氮源、生长因子、无机盐等），使
48、其有利于某一类群或某一种特定微生物的生长，而抑制其他微生物的生长。此外，也可以根据某些微生物对一些物理、化学因素的抗性来配制培养基，以抑制不需要的微生物的生长繁殖，创造有利于特定种类的微生物优先生长的条件。第三节 测定微生物的数量培养基的种类微生物种类繁多，为其配制的培养基种类也千差万别。一般来说，培养基种类可以依据培养基的物理状态、组成成分、应用功能进行划分。一、按组成成分1. 天然培养基：利用天然的动物、植物或微生物（包括其提取物）制成的培养基，其营养成分复杂而丰富，难以确切了解培养基的化学成分。阅读空间第一章 发酵工程利用微生物进行规模化生产20 二、直接计数法直接计数法中常用的是显微镜
49、直接计数法，这种方法是先将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放在血细胞计数板上，在显微镜下直接进行计数。根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内的微生物总数。直接计数法所需设备简单，可迅速得到结果，而且在计数的同时能观察到所研究微生物的形态特征，其缺点是所测得的结果是活菌体与死菌体的总和。一般适用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。稀释涂布平板计数法和显微镜直接计数法是测定微生物数量的常用方法。通过测定微生物数量，可以研究微生物在土壤、水、空气和食品中的繁殖状况，为监测环境质量、检测食品卫生质量等方面提供科学依据。学业检测1. 大肠杆菌是人和动物肠道中普遍存在的一种兼性厌氧菌，常
50、以其在水中的含量作为评价水质的指标之一。某研究机构使用“滤膜法”对受污染的河流水体进行了大肠杆菌活菌数目的测定。根据所学知识，尝试回答下列问题：（1）为了便于统计污染严重的水体中活菌的数目，需将水样进行适当稀释，例如取水样 1mL 加入无菌水 mL 制备稀释倍数为 102的稀释液，并照此依次制备 。（2）每个稀释倍数的菌液取 10mL 进行过滤，然后将滤膜放置在培养基上进行培养。如果经过培养后稀释倍数为 102的 4 个平板上菌落数分别为 43、47、42、48，那么每升河水中约含大肠杆菌 个。与血细胞计数板计数结果相比，此计数方法测得的细菌数目较 （多/少），其原因是 。2. 合成培养基：根
