1、ISBN 978-7-5499-9384-09 787549 993840审批号： 苏费核 （2021年） 0381号举报电话： 12315定价： 11.12元主编责任编辑出版发行排版印刷厂址开本印张版次印次书号定价盗版举报普通高中教科书生物学 选择性必修3生物技术与工程汪 忠李?江苏凤凰教育出版社（南京市湖南路1号A楼 邮编210009）南京紫藤制版印务中心江苏凤凰盐城印刷有限公司（电话：0515-88153008）盐城市亭湖开发区希望大道中路70号（邮编224001）890毫米 240毫米/9.2521年6月第1版21年6月第1次印刷 978-4999384-011.12元83658579
2、苏教版图书若有印装错误可向出版社联系调换质量热线：025-83658528025-83658526书名第一章发酵工程第一节 发酵工程的培养基5培养基的类型和基础培养基6特殊培养基7边做边学 搜集有关微生物培养基的资料8走进实验室 配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基9第二节 发酵工程的无菌技术13发酵工程的灭菌方法14发酵工程的灭菌设备15发酵工程的无菌操作器具18微生物接种和传代的无菌技术19边做边学 斜面接种和培养酵母菌20微生物分离、纯化和培养的无菌技术21走进实验室 通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落22走进实验室 分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数24第三节 传统发酵技术和产品27传统发酵技术
3、的本质是微生物的天然发酵28? ?传统发酵技术生产的食品28? ? 边做边学 水果的发酵加工制作果酒和果醋30走进实验室 制作酸奶31第四节 发酵工程及其应用34发酵工程利用了微生物的特定功能35发酵工程的一般过程36发酵工程应用广泛39边做边学 调查发酵工程在生活中的应用实例39目录绪论1第三章基因工程第一节 基因工程及其技术85基因工程是在多学科基础上发展而来的86基因工程的基本工具87聚合酶链式反应（PCR）技术90走进实验室 利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定91基因工程的基本操作程序94边做边学DNA的粗提取和鉴定96第二章细胞工程第一节 植物细胞工程46植物组织培养技术47
4、走进实验室 天竺葵的组织培养49植物体细胞杂交技术52第二节 植物细胞工程的应用57植物组织培养技术的应用58植物细胞培养技术的应用60第三节 动物细胞工程及其应用63动物细胞核移植技术及其应用64动物细胞培养技术及其应用65动物细胞融合技术及其应用66边做边学 搜集单克隆抗体在临床上实际应用的资料68干细胞技术及其应用69第四节 胚胎工程及其应用72哺乳动物胚胎发育的基本过程73体外受精技术76胚胎移植技术78胚胎分割技术80第二节 基因工程的应用价值102基因工程在农牧业中的应用价值103基因工程在食品业中的应用价值105基因工程在医药业中的应用价值105第三节 蛋白质工程109蛋白质工程
5、是基因工程的延伸110蛋白质工程的设计思路与应用112第一节 转基因产品的安全性119日常生活中的转基因产品越来越多120转基因产品与技术的安全问题受到关注122边做边学 开展“转基因食品是否安全”的辩论122第二节 我国禁止生殖性克隆人126治疗性克隆和生殖性克隆本质不同127设计试管婴儿与治疗性克隆128边做边学 搜集设计试管婴儿技术的资料128生殖性克隆人面临诸多问题129? ? 边做边学 搜集我国对待生殖性克隆人态度的资料129第三节 禁止生物武器132生物武器的危害133边做边学 搜集历史上使用生物武器的资料133我国反对生物武器及其技术和设备的扩散134第四章生物技术安全与伦理问题
6、绪绪论论一、为什么要学习“生物技术与工程”模块？生物技术和生物工程是既相互联系又有明显区别的两个概念。生物技术是以生物学理论为基础，结合其他基础科学，采用先进的科学技术手段，改造生物体或加工生物原料，以便为人类生产出所需产品或达到某种目的。生物技术不仅与生产相关，在基础研究方面，人们利用该项技术解决了许多过去无法解释的生物学重大问题。生物工程则是利用生物学知识与技术，操纵生物体遗传物质，从而获得具有特定的生物学功能的物质，并形成大规模的工业化生产，以满足人类生产生活的需要。简单地说，生物学是上游学科，偏重于理论性、前沿性和探索性的研究；生物技术是中游学科，偏重于实践与技术手段的研究；生物工程是
7、下游学科，将实验成果转化为实用的产品。那么，我们为什么要学习这些内容呢？首先，生物技术与工程发展迅猛，它们改变着社会与生活。21世纪以来的诺贝尔生理学或医学奖显示，许多科学发现和生物技术与工程有关（表1）。年份具体发现概述2001年发现细胞周期的关键调节因子2002年发现器官发育和细胞程序性死亡的遗传调控机理2003年在核磁共振成像方面的发现2004年发现嗅觉受体和嗅觉系统的组织方式2005年发现幽门螺杆菌及其与胃炎和胃溃疡的关系2006年发现RNA干扰双链RNA引发的沉默现象2007年在利用胚胎干细胞引入特异性基因修饰的原理上的发现2008年发现导致宫颈癌的人乳头状瘤病毒（HPV）发现人类免
8、疫缺陷病毒2009年发现端粒和端粒酶如何保护染色体2010年创立了体外受精技术2011年2012年发现成熟细胞可被重写成多功能细胞，细胞核重编程技术2013年发现细胞囊泡运输与调节机制2014年发现构成大脑定位系统的细胞2015年对于先天免疫系统激活原理的发现发现树突细胞和其在获得性免疫中的作用发现治疗丝虫寄生虫的新疗法发现治疗疟疾的新疗法2016年发现细胞自噬的机制2017年发现控制昼夜节律的分子机制2018年发现负性免疫调节治疗癌症的疗法表121世纪以来被授予诺贝尔生理学或医学奖的科学发现11900年科学的输血技术的应用让无数失血病人的生命得以延续；1928年青霉素的发现，使由细菌引起的传
9、染病得到有效遏制；1965年人工合成的牛胰岛素成为第一种“人工合成出来的生命物质”（图1）21世纪以来，发酵工程、细胞工程、基因工程等现代生物技术与工程的发展更加突飞猛进。其次，通过学习“生物技术与工程”模块的内容，我们能基于所学内容，积极思考与生物学有关的社会问题，尝试参与社会决策，承担一定的社会责任。随着社会的发展，生物技术与工程已经越来越广泛地应用到社会生产的各个方面，并对国民经济的增长起到巨大作用。学习“生物技术与工程”模块的内容，有助于我们理解科学、技术、社会的相互关系，包括理解生物科学技术对社会发展的作用，同时也了解技术可能带来的多方面影响。例如，有关生物技术与产品安全性问题备受社
10、会关注，学习了本模块的内容后，我们能利用生物学相关概念和原理，通过逻辑推理阐明个人立场，作出独立的决策。再如，我们能遵循正确的伦理道德，以敬畏生命的观念，针对生殖性克隆等社会热点问题进行科学判断。二、“生物技术与工程”模块有哪些学习内容？生物技术与工程对社会的影响早就成为大众关注的问题之一。我们将在“生物技术与工程”模块中学习哪些内容呢？“生物技术与工程”模块仅选取了生物学相关方面的最基本的内容。例如，我们会学到有关发酵工程、细胞工程、基因工程的相关知识，以及在此基础上认识有关生物技术与工程的安全与伦理问题。这些都将有助于我们形成四个大概念：“发酵工程利用微生物的特定功能规模化生产对人类有用的
11、产品”“细胞工程通过细胞水平上的操作，获得有用的生物体或其他产品”“基因工程赋予生物新的遗传特征”和“生物技术在造福人类社会的同时也可能会带来安全与伦理问题”（图2）。图1我国科学家在进行牛胰岛素的合成实验图2“生物技术与工程”模块主要学习内容发酵工程为人类提供多样化的生物产品发酵工程利用微生物的特定功能规模化生产对人类有用的产品动物细胞培养、核移植、细胞融合和干细胞技术以及胚胎工程等得到广泛应用蛋白质工程是基因工程的延续细胞工程通过细胞水平上的操作，获得有用的生物体或其他产品基因工程赋予生物新的遗传特征生物技术在造福人类社会的同时也可能会带来安全与伦理问题植物的组织培养和体细胞杂交等技术得到
12、广泛应用重组DNA技术得到广泛应用社会广泛关注转基因产品的安全性问题有目的地获取纯净的微生物培养物中国禁止生殖性克隆人，禁止生物武器2学习了这些内容，我们能理解日常生活中的腐乳、抗生素等都与发酵工程有关；也能认识到利用组织培养技术可以大规模培养花卉，利用体细胞克隆技术可以培育出克隆羊多莉；还能参与有关转基因产品或生殖性克隆人安全和伦理问题的社会讨论，并作出相应决策等。三、如何学习“生物技术与工程”模块的内容？“生物技术与工程”模块要求我们重点理解的大概念和若干重要概念中，有些内容我们在必修模块已经有了初步的了解，有些则可能第一次接触。学习本模块的内容要特别注意以下几个方面。首先，要积极参与实验
13、活动。“生物技术与工程”模块是偏重实践类的课程，其中的实验活动是本模块的重要组成内容，也是我们学习的基本形式之一。这些实验活动对我们掌握四个大概念及若干重要概念有很大的帮助。通过实验活动感悟到生物技术与工程在生产生活中的实际应用价值，是我们达成生物学学科核心素养的重要支撑。“生物技术与工程”模块中的实验活动有的是定性的，有的是定量的。我们不仅要重视定性的实验活动，也要重视定量的实验活动。因为在定量的实验活动中，我们可以学习相关的测量方法，实事求是地记录、整理和分析实验数据，定量表述实验结果，从而了解科学探究的本质。在实验中我们要注意安全地使用实验器具（如解剖器具、玻璃器皿、酒精灯）和实验药品（
14、如酸、碱试剂），这些也是生物学实验的基本技能。注意妥善处理实验废弃物是实验操作的基本要求，也是环境保护意识的具体体现。其次，要关注科学、技术和社会的相互关系。“生物技术与工程”模块的重要主线之一是注重科学、技术和社会的相互关系。科学、技术和社会相互关系的问题涵盖面很广，包括全球的、国家的和地区的科学技术与社会生活、生产发展相关的问题。我们可以结合所学内容，从关注本地区问题开始，或从图书、报刊和网络获取的问题开始，积极思考与生物学有关的社会问题，理解生物科学技术对社会发展的作用，同时也了解生物技术的发展可能带来的多方面影响。了解科学、技术和社会的相互关系，关注并参与和生物科学技术有关的个人与社会
15、问题的讨论和决策，是生物科学素养的重要组成部分，也是我们形成对自然和社会的责任感的重要途径。我们可以针对具体事例开展调查、研究、讨论等活动，认识生物学与社会发展的紧密联系，并在此基础上尝试参与社会决策。3发酵工程常用的大型发酵罐日常生活中，我们所熟知的腐乳、酱、醋、豆豉、泡菜等都是传统发酵技术的产品。现在，在传统发酵技术的基础上，发酵工程迅速崛起，通过大型发酵罐等精良设备和先进技术，人们正在生产出更加多样化的产品。我们能说出日常生活中与发酵工程有关的产品吗？这些产品是如何生产出来的？发酵工程对我们的生活和生产还有哪些重要影响？第第一一节节发发酵酵工工程程的的培培养养基基说起发酵工程（ferme
16、ntation engineering），我们首先就会想到培养基。我们一般都有这样的经验，一碗米饭放置在温暖环境下，几天后会长出许多细菌和霉菌，这碗米饭就成了培养细菌和霉菌的培养基。米饭中不仅含有大量的淀粉，还含有一定量的蛋白质和脂肪。当然，发酵工程中的培养基绝不像一碗米饭那么简单。那么，发酵工程中的培养基究竟是什么呢？事实：1.谈到培养基还需要从琼脂说起。琼脂是从某些藻类细胞中提取出来的物质，主要包括琼脂糖（一种多糖）和小分子果胶两种成分。绝大多数生物包括微生物都不能利用它们。所以，在纯琼脂（含水）培养基上，一般也没有微生物可以生长。但是，如果在琼脂中添加一定量的碳源、氮源物质，就可能成为微
17、生物培养基。2.美国一位微生物学家在她八岁的儿子从外面玩耍回来之后，让他用右手在添加了水、碳源和氮源等物质的琼脂培养基上按了一下。接着，她将这个培养皿放在恒温箱中培养了48 h，得到如右图所示的微生物菌落分布（图1 - 1 - 1）。思考：1.分析 有人认为，上述事实能说明碳源和氮源等物质是许多微生物生长发育所需要的营养物质。我们认同这样的观点吗？2.推测 根据我们对微生物和动植物的了解，如果发酵工程需要配制培养基以培养某些微生物或动植物细胞，这些培养基应该包括哪些营养物质？积积极极思思维维发酵工程中的培养基究竟是什么呢？经过思考我们应该会得出这样的结论：培养基应该含有生物生长发育所需的各类营
18、养物质。那么，在发酵工程中会用到哪些培养基？这些培养基中的营养成分都一样吗？怎样配制这些培养基？图1 - 1 - 1印有手印的培养基上显示的微生物菌落5培养基的类型和基础培养基跨学科视角实验室配制合成培养基时，常需要采用试剂瓶上有“分析纯”字样的化学试剂。从化学视角来说明什么是分析纯试剂。约6 mL约15 mL斜面培养基正面观和侧面观平板培养基（此平板直径9 cm）图1 - 1 - 2斜面和平板培养基示意图培养基的类型培养基（culture medium）主要是指为人工培养微生物等而制备的，适合微生物等生长、繁殖或积累代谢产物的营养基质。按照培养基成分的不同，可以将培养基分为天然培养基和合成培
19、养基等类型。天然培养基由动植物组织或微生物细胞以及它们的提取物或粗消化物配制而成，如牛肉膏蛋白胨培养基。天然培养基的主要优点是取材便利、营养丰富、配制简便，缺点是营养成分难以控制、实验结果的重复性较差。天然培养基比较适用于工业化生产。合成培养基由准确称量的高纯度化学试剂加蒸馏水配制而成，如葡萄糖铵盐培养基。合成培养基的优点是化学成分及其含量明确、实验的可重复性好，缺点是配制过程繁琐、成本较高。合成培养基多用于研究和育种。按照培养基物理性质的不同，可以将培养基分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基。配制固体培养基时，需要在液体培养基中添加一定量的凝固剂。琼脂就是一种常用的凝固剂。在液体培养基中
20、加入适量琼脂后，即可配制成固体培养基或半固体培养基。添加琼脂后，利用琼脂加热熔化和冷却凝固的特点，可以配制成用于接种、保存和培养微生物的斜面培养基或平板培养基（图1 - 1 - 2）。在配制培养基时，根据拟培养微生物种类和培养目的的不同，有时还要加入维生素等特殊的营养物质，并要调节培养基的pH使之满足微生物生长的需要。按照培养基用途的不同，可以将培养基分为基础培养基（minimum medium）和特殊培养基。基础培养基各种培养基的配方虽然不同，但其成分一般都含有水、碳源（主要提供含碳元素的物质）、氮源（主要提供含氮元素的物6很多微生物不能直接利用尿素，而有些微生物能以尿素为氮源。你能设计出以
21、尿素为唯一氮源的选择培养基吗？特殊培养基以基础培养基为基础，可进一步配制具有特殊用途的培养基，即特殊培养基。选择培养基选择培养基（selective medium）是一种能将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的特殊培养基。一类选择培养基是依据某些微生物的特殊营养需求设计出来的。例如，利用以纤维素为唯一碳源的选择培养基，可以分离出能分解纤维素的微生物；利用缺乏氮源的培养基，能分离出固氮微生物。另一类选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，这些化学物质虽然没有营养作用，但可抑制或杀死其他微生物。例如，在选择培养基中添加数滴质量分数为10%的酚溶液可以抑制细菌和霉菌的生长，培养基上仅有放线
22、菌生长；在培养基中添加亚硫酸铋，可以选择培养出伤寒沙门氏菌；在培养基中添加青霉素、四环素等，通过抑制某些细菌或放线菌的生长，可以选择培养出酵母菌或霉菌等真菌。自然界中有一些微生物是自养型微生物。它们的碳源是哪些物质？质）和无机盐等最基本的物质，这些最基本的物质是大多数微生物对营养条件的基本需求，提供这些基本需求的培养基就是基础培养基。常用的牛肉膏蛋白胨培养基就是一种基础培养基。碳源是构成微生物体的重要成分，也是微生物生命活动的能量来源。碳源物质主要包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉和纤维素等。淀粉是一种能被大多数微生物利用的碳源，但也有一些微生物（如谷氨酸产生菌）不能利用淀粉，而只能利用葡萄糖、果
23、糖、蔗糖和麦芽糖等糖类。氮源的种类对微生物的生长和代谢的影响是多方面的。氮作为构成微生物细胞中蛋白质和核酸的主要元素，一般可将氮源分为无机氮源和有机氮源。发酵工业中常用的无机氮源包括硝酸盐、铵盐等，有机氮源包括豆饼粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉等。无机盐也是培养基的重要成分。例如，磷作为构成磷脂、核酸和ATP的必要元素，是微生物生长繁殖所必需的，也是合成多种代谢产物所必需的营养物质。在发酵过程中，微生物从培养基中摄取的磷一般以磷酸盐的形式存在。因此，培养基中磷酸盐的浓度对菌体的生长和产物的合成有一定的影响。为了满足微生物生长、繁殖和生成代谢产物过程中的营养需要，还需要合理添加其他必要的无机盐。7鉴
24、别培养基鉴别培养基（differential medium）是用于快速分类鉴定不同类型微生物的特殊培养基，也可用于分离和筛选产生某种代谢产物（metabolite）的微生物菌种。例如，一些微生物可以产生胞外淀粉酶，将样品微生物培养在添加可溶性淀粉的培养基中，如果其菌落周围形成淀粉水解圈，说明它们是能产生淀粉酶的菌株；一些微生物可以产生乳酸、醋酸或丙酸等代谢产物，将样品微生物培养在添加了溴甲酚紫的培养基中，如果培养基的颜色由紫色转为黄色，说明它们是产酸微生物。加富培养基加富培养基（enrichment medium）也称营养培养基，即在培养基中加入有利于某些微生物生长和繁殖所需的特殊物质，如血液
25、、血清、酵母浸膏、动植物组织液。加富培养基一般用于培养营养要求比较苛刻的异养微生物。例如，培养百日咳博德氏菌需要含有血液成分的加富培养基。从某种意义上来说，加富培养基类似于选择培养基。二者不同的是，采用加富培养基的目的，是增加所需分离的微生物的数量，使其形成生长优势，以分离出该种微生物；采用选择培养基的目的，一般是抑制不需要的微生物生长和繁殖，而使所需要的微生物增殖，再分离出所需微生物。无论是以微生物为材料的研究，还是利用微生物生产生物制品（如代谢产物），都必须配制相应的培养基，这是发酵工程研究和生产的基础。配制发酵工程所需的培养基，首先需要确定培养基的配方，然后还需要确定相应的配制方法。你能
26、简要说明选择培养基与鉴别培养基的主要区别是什么吗？实践：1.通过互联网或图书馆搜集有关微生物培养基的资料，如培养基的种类和主要用途。2.搜集培养细菌、酵母菌、霉菌和放线菌的典型培养基配方，也可查阅有关“选择培养基和鉴别培养基”的资料。讨论：1.培养细菌、真菌等不同微生物的培养基的配方有所不同，其原因是什么？2.如何设计培养某种微生物的“选择培养基”或“鉴别培养基”？边边做做边边学学搜集有关微生物培养基的资料培养细菌的天然培养基主要有牛肉膏蛋白胨培养基等。牛肉膏蛋白胨培养基的常用配方：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂1520 g、水1 000 mL。8知识链接牛肉膏蛋白胨培养
27、基的配制按照牛肉膏蛋白胨培养基的配方比例，依次准确地称取相应质量的牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。称取牛肉膏时，常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯中。也可以将其放在称量纸（防水）上称量，然后连着称量纸一起放入水中。这时稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，立即取出纸片即可。蛋白胨极易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称量试剂时要严防试剂混杂，一把牛角试剂匙只用于一种试剂，或称取一种试剂后洗净、擦干，再称取另一种试剂，瓶盖也不能盖错。在上述烧杯中可先加入少于配制培养基所需要量的水，用玻棒搅匀，加热溶解。待试剂完全溶解后，补充加水到所需的总体积。如果配制固体培养基，先将称好
28、的琼脂放入已溶化的试剂中，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所缺的水。在未调节pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH。如果pH偏酸，可向培养基中逐滴加入物质的量浓度为1 molL-1的NaOH溶液，边加边搅拌，并随时测其pH，直至pH达到要求。反之，则用物质的量浓度为1 molL-1的HCl溶液进行调节。注意pH不要调得过酸或过碱，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。有些微生物对pH的要求比较精确，在调节其培养基的pH时，可用酸度计进行测量。培养基配制好后，可以根据需要趁热用滤纸或多层纱布过滤，或按要求将配制的培养基分装入试管或三角烧瓶内。走进实验室配制马铃
29、薯葡萄糖琼脂培养基微生物种类繁多，在自然界分布广泛，其中酵母菌与我们的日常生活有密切关系。为了研究酵母菌的特性，需要培养出大量的酵母菌，这就必须配制培养酵母菌的培养基。很多培养基都可以培养酵母菌，本实验通过配制常用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养酵母菌。实验目的学会配制培养基，如培养酵母菌的培养基。实验原理酵母菌生长繁殖需要的营养物质有水、碳源、氮源和无机盐等。马铃薯葡萄糖琼脂培养基具有酵母菌生长所需的碳元素、氮元素和其他营养物质。实验器材和试剂分离和培养放线菌通常用高氏号培养基等合成培养基。高氏号培养基的配方为：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、NaCl 0.5 g、K2HPO43H2O 0.
30、5 g、MgSO47H2O 0.5 g、FeSO47H2O0.01g、琼脂1520 g、水1 000 mL。无论是配制牛肉膏蛋白胨培养基，还是配制高氏号培养基等，都需要根据培养目的调节培养基的pH。对培养基进行灭菌（sterilization）是获得纯净的微生物培养物的前提。配制完成的培养基必须经过灭菌处理才能用于微生物的培养。实验室一般用高压蒸汽灭菌锅（high鄄pressuresteam sterilizer）进行灭菌。9烧杯、玻棒、试管、培养皿、铁架台、高压蒸汽灭菌锅、酒精灯、pH试纸，蒸馏水、马铃薯块茎、葡萄糖、琼脂等。实验步骤配制培养基马铃薯块茎200 g（去皮），切成小块，加水1
31、000 mL煮烂（用玻璃棒能戳动即可）；用4层纱布过滤；取滤液，在滤液中加葡萄糖20 g和琼脂1520 g；加热溶液，待其中琼脂溶化后补足水至1 000 mL。需要精确称量试剂时可使用电子天平。调节测试并调节培养基的酸碱度时，先用玻璃棒蘸取液态培养基，接触试纸测试其，再根据实际情况用物质的量浓度为1 molL-1的溶液将培养基调至55。分装待培养基冷却到50 左右时，将培养基分装到洁净的试管（图1 - 1 - 3）或培养皿中。分装时注意不要污染试管口，随后立即用棉花塞或试管盖盖紧试管口。若制作斜面培养基，倒入试管中的培养基高度约为试管高度的。灭菌后，使管内培养基自然倾斜，凝固后即成斜面培养基。
32、包扎在试管壁或培养皿底部上注明培养基的名称、组别、配制日期等信息。以35支培养基斜面试管或35个培养基平板为一个单位，用牛皮纸包扎起来。灭菌采用高压蒸汽灭菌锅灭菌，压力设定为100 kPa，温度为121 ，灭菌20 min。结果与分析按照配方和配制方法配制的培养基，可留作酵母菌培养实验之用。除上述培养基外，麦芽汁培养基也是常用的酵母菌培养基。技能指导正确和规范操作电子天平1.电子天平要正确安放在安全称重室或稳固的工作台上，规避由环境因素带来的气流波动、温度变化、振动和静电等的干扰。2.电子天平放置后必须将水平泡调至水平仪中心位置。3.电子天平预热是为了保证天平在预热时间内，进行机械性自检和环境
33、温度监测，从而达到天平系统的正常稳定，所以天平在预热状态时最好不要使用和操作。4.电子天平使用前必须先用砝码测试其准确度，如果发现存在误差，需先校正，后称重。只有做到正确和规范操作天平（包括普通天平），才能帮助我们快速精确地完成称量试剂的工作任务。图1 - 1 - 3分装培养基示意图10发酵工程发酵工程是我国重点发展的工程技术之一。发酵工程通过改变遗传物质、调控细胞代谢关键酶及其相应的现代装备，实现细胞的大规模培养，从而获得各种生物活性物质等。发酵工程专业可培养能熟练运用专业知识和技术进行理论研究和生产实践，具有从事该专业实际工作与科学研究工作能力的专门人才。学生毕业后可从事与发酵工程有关的医
34、药、农业、化工、食品及环保等领域的工作。如果你想要更多地了解本专业的相关情况，请访问我国关于专业介绍的网站。发酵工程专业的学生在实验室学习操作小型发酵罐本节练习一、思辨题1.科学地选用和设计适合微生物生长需求的培养基是进行微生物实验的前提，培养基的种类各异，下列对各种培养基的分析和实际不相符的是（）A.天然培养基营养成分丰富且复杂，一般用于发酵工业生产B.在液体培养基中添加一定量的琼脂，可以配制成固体培养基C.淀粉是一种能被所有微生物利用的碳源，是培养基的主要成分D.在选择培养基中滴加一定浓度的酚溶液可以抑制细菌的生长2.基础培养基和特殊培养基是生产和科学研究中常用的培养基。请说出它们的区别与
35、联系。二、应用题1红曲自古以来就被我国人民用于食品的着色。宋代，人们就已经利用红曲霉具有耐酸和耐高温的特性，获得了纯度很高的红曲。（1）某同学查阅资料得知：红曲霉属真菌门，是异养类微生物。他想要配制适合红曲霉生长的培养基，应该如何进行培养基的配制？（2）该同学采用单因子实验研究了不同的培养基对红曲霉产色的影响，结果表明：在培养基pH为6.0时，培养72 h，红曲霉着色效果最好。这是一个选择培养基的应用实例。我们还能列举出其他选择培养基的应用实例吗？2培养基中的氮源分为有机氮源和无机氮源。这两类物质在微生物培养中的作用有什么不同？如果理解这个问题有困难，可以通过互联网或图书馆查阅相关资料。11课
36、课外外阅阅读读革兰氏染色法革兰氏染色法是1884年由丹麦科学家革兰（H. C. Gram，18531938）发明的，它是细菌学中重要的鉴别染色法。革兰氏染色的基本步骤：先用初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如番红）复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌（左图）。运用革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。这是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染
37、剂，能与结晶紫结合成结晶紫碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质含量高，所以脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。固定结晶紫初染碘液媒染体积分数为95%的酒精脱色番红复染革
38、兰氏阳性菌（G+）革兰氏阴性菌（G-）革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌示意图12第第二二节节发发酵酵工工程程的的无无菌菌技技术术19世纪中期以前，人们普遍相信生命现象可以随时随地自然发生。后来，这一观点被科学证明是错误的。但是，随着运用显微镜发现微生物后，人们又开始感到困惑，因为“肉汤腐败”现象说明微生物可能真的会自然发生。那么，肉汤腐败与微生物有什么关系？事实：1.许多科学家都想用实证的方法证明微生物的自然发生说是错误的，但都无法设计出实验并得出有说服力的结果。直到19世纪60年代，法国科学家巴斯德（L. Pasteur，18221895）令人信服地解决了这一问题。他设计了一个具有弯曲瓶颈的圆底烧
39、瓶，烧瓶里有煮沸的肉汤。一段时间后，肉汤并没有发生腐败（图1 - 2 - 1）。2.巴斯德通过高温加热烧瓶中的肉汤，烧瓶通过开口的曲颈和外界相通。这样既能杀死瓶内的各种微生物，又能阻隔外界微生物进入烧瓶。因为没有污染，肉汤就没有发生腐败。巴斯德的这一操作也让人们开始关注无菌操作的重要性。思考：1.分析 巴斯德的实验能说明微生物与肉汤腐败的关系吗？2.推测 巴斯德的成功取决于他重视实验的无菌操作。分析上述事实，他的无菌操作体现在哪些方面？积积极极思思维维肉汤腐败与微生物有什么关系？巴斯德在实验中注意到无菌操作是他实验成功的保证。日常生活中，我们会用碘伏消毒液擦拭受伤破损的皮肤，从而杀灭伤口部位的
40、部分微生物。那么，在发酵工程实践中无菌操作是如何开展的呢？巴斯德设计的具有弯曲瓶颈的圆底烧瓶和肉汤巴斯德在实验圆底烧瓶曲颈煮沸后的肉汤图1 - 2 - 1巴斯德实验示意图13图1 - 2 - 2发酵工程的无菌操作室发酵工程的灭菌方法获得纯净的微生物培养物是发酵工程的基础。因此，无菌技术是发酵工程的重要技术之一，是指在操作过程中，保持物品与操作区域的无菌状态并不被微生物污染的技术，其核心是灭菌。发酵工程的培养基含有比较丰富的营养物质，所以很容易受到各种杂菌的污染。而发酵工程的生产过程只有在没有杂菌污染的情况下才能正常进行（图1 - 2 - 2）。在发酵工程中常采用化学的、物理的方法杀灭或去除设备
41、和相关材料中的微生物。化学试剂灭菌法一些化学试剂如甲醛、氯、高锰酸钾，能破坏微生物的蛋白质或细胞结构，具有杀菌作用，可以用作灭菌剂（sterilant）。采用灭菌剂灭菌的方法称为化学试剂灭菌法。由于灭菌剂可能会与培养基中的一些成分发生作用，因此化学试剂灭菌法一般不用于培养基的灭菌。射线灭菌法利用紫外线等产生的高能粒子进行灭菌的方法称为射线灭菌法。波长为200300 nm的紫外线有较好的灭菌作用。但紫外线的穿透力弱，一般用于表面和空气的灭菌。X射线和射线也常用于灭菌。干热灭菌法常用的干热灭菌法包括干热空气灭菌法和火焰灼烧法等。干热空气灭菌的条件一般是140160 ，23 h，主要用于要求保持干燥
42、的实验器具（如培养皿、接种针和移液管）的灭菌；火焰灼烧法常用于接种等操作过程。湿热灭菌法利用饱和蒸汽进行灭菌的方法称为湿热灭菌法，一般在温度为121 、气压约100 kPa的条件下维持1520 min。因湿热灭菌时蒸汽穿透力大，蒸汽与较低温的物体表面接触凝结问题与讨论外科医生在做手术前要对手进行消毒处理。有人认为，消毒是将传播媒介上的病原微生物清除或杀灭，但并不能杀死所有微生物（如细菌的芽孢）。我们同意上述观点吗？消毒和灭菌有什么差别？能说出我们日常生活中常用的消毒方法吗？14发酵工程的灭菌设备过滤除菌法通过过滤阻留微生物从而达到除菌目的的方法称为过滤除菌法。工业生产上一般利用过滤除菌法大量地
43、制备无菌空气，用于好氧微生物的发酵。在产品提取过程中，也可以利用过滤除菌法处理料液，以获得无菌产品。在具体的研究或生产实践中，上述几种方法有时可以结合使用，灭菌效果会更为显著。灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。知识链接发酵工程中培养基的灭菌在发酵工程中，常采用分批灭菌和连续灭菌两种方式，利用饱和蒸汽对培养基进行湿热灭菌。培养基的分批灭菌培养基的分批灭菌是指将配制好的培养基放在发酵罐中，通入蒸汽进行灭菌的过程，也称为实罐灭菌。分批灭菌的过程包括升温、保温和冷却三个阶段，灭菌主要是在保温过程中实现的。分批灭菌对蒸汽压力的要求较低，一般在31024102kPa即可。但在灭菌过程中蒸汽用量变化大，造
44、成锅炉负荷波动大。分批灭菌不需要专门的灭菌设备，投资较少，设备相对简单。培养基的连续灭菌培养基的连续灭菌是在高温条件下，将配制好的培养基在向发酵罐输送的过程中进行加热、保温、冷却，并实施灭菌的方法。连续灭菌时，培养基能在短时间内加热到保温温度，并能很快被冷却。因此，可在比分批灭菌更高的温度下灭菌，其保温时间很短，有利于减少营养物质的破坏。在连续灭菌的过程中，蒸汽用量平稳，但蒸汽压力一般要求高于5102kPa。连续灭菌投资较大、设备相对复杂。在科学研究或生产实践中，灭菌需要采用相应的灭菌设备。电热鼓风干燥箱实验室通常使用恒温控制的电热鼓风干燥箱作为干热灭菌设备。它是具有双层金属壁、中间有隔热石棉
45、板的箱体，其顶端或背面有调气阀，下底夹层装有供通电加热的电炉丝（图1 - 2 - 3）。电热鼓风干燥箱常用于空的玻璃器皿（如培养皿、离心管、移液管）、金属用具（如镊子、手术刀）和其他耐高温的物品（如菌种保藏采用的沙土管、石蜡油、碳酸钙）的灭菌。其优点是使灭菌器皿保持干燥。但带有胶皮或塑料的物品、液体及固体培养基一般不能采用电热鼓风干燥箱干热灭菌。为水时可放出大量能量，吸收了蒸汽水分和热量的菌体蛋白质易变性，在相同温度下湿热灭菌比干热灭菌更有效。图1 - 2 - 3一种电热鼓风干燥箱15图1 - 2 - 4一种高压蒸汽灭菌锅的结构示意图安全阀压力表排气阀软管固定螺栓灭菌桶筛架水菌体蛋白质的变性温
46、度与含水量密切相关，如细菌、酵母菌及霉菌的营养细胞，因为含水量较高，在5060 条件下，加热10 min即可使其蛋白质变性而达到杀菌效果；对于含水较少的放线菌及霉菌孢子，在8090 条件下，加热30 min方可杀菌。细菌芽孢含水量低，蛋白质变性温度较高。采用电热鼓风干燥箱干热灭菌时，一般以能否杀死细菌的芽孢作为彻底灭菌的标准，这就需要将温度提高到约160 ，加热23 h。使用电热鼓风干燥箱要按产品说明书进行操作，特别要注意相关的安全事项。例如，不得将易腐、易燃、易爆物品放入箱内干燥灭菌；干燥箱在工作时，必须将风机开关打开，否则会导致电机或传感器烧坏；箱内应经常保持清洁，长期不用应套好防尘罩，放
47、置在干燥的室内等。高压蒸汽灭菌锅采用高压蒸汽灭菌锅进行湿热灭菌是应用广泛的一种灭菌方法。其灭菌原理是在一个密闭的锅内，水的沸点随蒸汽压力的增高而上升，加压的同时提高蒸汽的温度，使锅内的待灭菌物品在一定压力和温度等条件下，杀死其中所有微生物的营养体及其芽孢。高压蒸汽灭菌锅主要有手动式高压蒸汽灭菌锅（图1 - 2 - 4）和全自动高压蒸汽灭菌锅两类。使用高压蒸汽灭菌锅时，操作人员必须在现场规范操作，严格控制热源维持灭菌时的压力。锅内压力过高，不仅培养基的营养成分会被破坏，而且高压锅超过耐压范围后可能会发生爆炸，造成伤人事故等。使用高压蒸汽灭菌锅灭菌，一般须经加水、装锅、加热、排空冷空气、保温保压、
48、出锅等步骤。加水是指使用前在外层锅内加入适量的水，水量达到水位标记线即可。加水的量不可过少，以防止灭菌锅烧干。装锅是指将待灭菌物品放在灭菌桶中，灭菌桶不要装得过满，至少留1/3空间。然后盖好锅盖，对称地旋紧锅盖四周的固定螺栓。加热后，随着锅内压力逐渐增加，须打开排气阀，排出锅内残留的冷空气。当压力表指针回降到“0”时，关闭气阀，继续加热。如待灭菌物品较大或不易通气，应适当延长排气时间，务必使冷空气充分排出，再将排气阀关闭。保温保压是指当锅内压力升至约103k、温度达到 时控制热源，保持压力，维持1520 后，再关闭电源。16出锅是指当压力表指针降至“”点，待温度下降后，打开排气阀，旋开固定螺栓
49、，开盖，取出灭菌物品。灭菌完毕取出物品后，将锅内余水倒出，保持灭菌锅内壁及内胆干燥，并盖好锅盖。问题与讨论有经验的同学知道，在高压蒸汽灭菌锅内的压力没有降到“0”点前不能打开高压蒸汽灭菌锅的锅盖。考虑到放入高压蒸汽灭菌锅内待灭菌的物品可能有玻璃器皿或培养基，如果压力没有降到“0”点，而高压蒸汽灭菌锅的锅盖突然被打开，会发生什么情况？空气粗过滤器压缩机贮罐水冷却器气液分离器蒸汽加热器无菌空气空气过滤器过滤介质图1 - 2 - 5空气过滤除菌流程示意图有人说空气过滤除菌法能杀死空气中的微生物。你能根据实例质疑他的观点吗？空气过滤除菌是让含菌空气通过无菌干燥的过滤介质，以阻截空气中所含微生物。这样空
50、气含菌量会降低到一个极低的比例，发酵受污染的概率就会大大减小。也就是说，通过过滤除菌处理的空气可达到几乎无菌的程度，并有足够的压力和适宜的温度，以满足好氧微生物纯培养的需要。各种不同的发酵过程，对空气无菌程度的要求也不同。例如，酵母菌繁殖得快，对空气的无菌要求相对较低；而制备氨基酸、抗生素等的发酵过程，所需的微生物对空气无菌的要求较高。空气除菌设备许多微生物产品是通过培养好氧微生物获得的。通常在空气中含有灰尘颗粒和各种杂菌，在阴雨天气或环境污染比较严重的情况下，空气中会悬浮大量的微生物。这些微生物一旦进入营养丰富的培养基中，会很快繁殖，影响发酵过程。因此，空气除菌就成为好氧发酵的关键环节。发酵
