1、普通高中教科书生物学选择性必修3生物技术与工程刘恩山杭州市体育场路347号邮政编码： 310006办公室电话： 0571-85176593销售部电话： 0571-85176040网址： E-mail： 杭州兴邦电子印务有限公司浙江新华数码印务有限公司89012401/16印张10207 0002021年3月第1版印次2021年11月第2次印刷ISBN 978-7-5341-8676-9定价12.09元浙江科学技术出版社书名主编出版发行排版印刷开本字数版次书号版权所有翻印必究（图书出现倒装、 缺页等印装质量问题， 本社销售部负责调换）定价批准文号： 浙发改价格 2019 319号、2020 33
2、1号举报电话： 12345、 12315责任编辑顾旻波曹梦洁责任校对赵艳责任美编金晖责任印务田文主编刘恩山副 主 编朱立祥李晓辉本册执行主编陈月艳本册编写人员 （按姓氏笔画排序）刘晟张超张瑾陈月艳管旭同学们：自从有了人类的历史，就有了人类利用生物的历史。现在，我们就要开始学习选择性必修模块生物技术与工程了。这一课程是偏重技术实践类的课程，是对高中生物学必修课程知识的进一步拓展和应用。生物技术 （biotechnology） 是一门既古老又现代的技术。说它古老，是因为它的起源可以追溯到古人的酿酒工艺，其历史几乎与人类的文明史一样源远流长；说它现代，是因为生物技术的产品日新月异，我们所熟知的克隆羊
3、“多莉” 、人类基因组被破译、转基因大豆等都是现代生物技术的成果。生物技术又称生物工程 （bioengineering） 。对生物技术如何下定义，一直是个有争议的问题，常因研究领域不同而有差异。随着生物技术的迅猛发展，1982年，国际合作及发展组织对“生物技术”这一名词进行了定义：生物技术是应用自然科学及工程学的原理，以微生物、动物、植物为反应器，将物料进行加工，以提供产品为社会服务的技术。例如，以酵母菌为反应器制酒、以醋杆菌为反应器制醋、以毛霉为反应器制腐乳、以青霉菌为反应器生产青霉素、以植物细胞为反应器生产抗癌药物紫杉醇、以转基因的大肠杆菌为反应器生产人胰岛素、以羊乳腺为反应器生产治疗人血
4、友病的凝血因子等。可见，生物技术是利用活的生物个体、器官、组织和细胞进行生产，来增加和丰富产品的品种，提高人们的生活质量。传统的生物技术从史前时代就一直为人们所开发和利用，主要是通过微生物的发酵来生产产品的技术。在殷墟出土的文物青铜器中就致同学们1有酒具，表明在公元前15世纪，我国就能酿酒。 尚书中有“若作酒醴，尔惟曲蘖”的记载，意思是：要做甜酒，你必须用酒曲。醴是甜酒的意思，现在看来酒曲就是酵母菌菌种。17 世纪前，尽管人们将微生物用于食品加工等，但是对于微生物本身是“触而不觉、食而不察、得其意而不知其好、受其害而不知其恶”的状态。1676年，列文虎克（Antony van Leeuwenh
5、oek，16321723）用自制的显微镜首次观察到细菌，开启了人类认识微生物世界的大门。微生物学创始人巴斯德 （Louis Pasteur，18221895）在面临酒变酸、蚕微粒子病、牛和羊的炭疽病、人狂犬病等具体问题时，揭示了发酵的原理，证明发酵、腐败和传染病都与活的微生物有关。自此，人类开始有意识地利用酵母菌等微生物进行大规模发酵，生产酒精、乳酸、面包酵母、柠檬酸等产品。1928年，英国医生弗莱明 （Alex-ander Fleming，18811955） 发现青霉菌能产生青霉素。这一伟大发现不仅在第二次世界大战期间及战后拯救了成千上万人的生命，而且在实现青霉素的工业化生产过程中，逐渐形成
6、了近代生物工程这门快速发展的学科。青霉素的工业开发获得成功，成为近代生物工程的标志。20世纪40年代，以获取微生物的代谢产物抗生素为主要特征的抗生素工业成为生物技术的支柱产业。20世纪5060年代，氨基酸、酶制剂等成为发酵产品的新成员。人们还成功地利用诱变育种的手段获得微生物的突变体，以改良菌种，提高发酵产品的产量。以微生物发酵为主的生物技术在发展过程中，从家庭走向工厂，从食品加工到应用于生产和生活的各个领域，对提高人们的生活质量和身体健康水平具有重要意义。不过，对微生物进行诱变和选择的过程只能提高微生物某种已有的功能，并不能赋予其新的遗传特性，这就限制了生物技术的应用范围。科学与技术，如同两
7、个互动的车轮，它们的协调和飞速运转，是现代社会发展的重要特征。1953 年，沃森 （James D. Watson，1928） 和克里克 （Francis Crick，19162004）揭示了DNA的双螺旋结构，随后遗传密码的破译等一系列重大科学发现终于使得人们对DNA的操作将外源目的基因转入某种生物体内并生产有价值的产品成为可能，现代生物技术的主体技术基因工程应运而生。正如沃森所言： “我和克里克很快就认识到我们的发现在思想意义上的重要性，但我们怎么也料想不到，DNA双螺旋结构的发现竟对科学和社会产生爆炸性的影响我们不再只是旁观大自2然，而是能实际解读生命的基本蓝图，插手生物的DNA。我们终
8、于能够对付从纤维囊泡症到癌症等不同的遗传疾病，能运用DNA指纹技术推动刑侦案件调查的革命。我们能以先前梦想不到的有效方法，改善农作物品种”沃森所言种种，正是基因工程给我们的生活所带来的巨大变化，它带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。与传统生物技术相比，现代生物技术的一个重要特征是对生物材料的结构或物质进行拆分、修改、增删、重组，以此来满足人类对健康、发展的需求。根据生物工程的操作对象和操作技术上的差异，生物工程主要包括基因工程（gene engineering） 、细胞工程 （cell engineering） 、发酵工程 （fermentation enginee
9、r-ing） 、蛋白质工程 （protein engineering） 、胚胎工程 （embryo engineering） 、酶工程（enzyme engineering）和生态工程（ecological engineering） 。例如，人们可以利用发酵工程大规模工业化培养青霉菌，以获得青霉素；利用植物细胞工程获得脱病毒的植株；利用动物细胞工程培育出克隆羊、克隆猪、克隆牛；利用基因工程获得被转入了毒蛋白基因的抗虫棉其中，作为生物工程的主体基因工程的发展，带动和促进了细胞工程、发酵工程、蛋白质工程等领域的发展，在食品、医疗、农业、环保等方面产生重大影响。随着生物工程的迅猛发展，生物工程各分支
10、领域之间的界限已趋于模糊，它们相互交叉，相互补充，高度综合。例如，人们可以利用经过改造的大肠杆菌在装有培养液的发酵罐中大量生产人的胰岛素，就是综合运用工程技术的成果，即利用基因工程从分子水平上改变物种的遗传特性，再通过发酵工程来实现其产业化。商品属性是生物技术区别于生命科学的特性之一，高技术、高投入、高产出是生物技术产业的显著特点。如今，生物技术的开发和应用日趋广泛和深入，吸引了越来越多的人从事与生物技术研发和生产相关的职业。从公元前原始的酿造技术，到20世纪70年代的转基因技术，直至20世纪90年代3的高等哺乳动物无性繁殖技术和21世纪初人类基因组序列的公布，生物技术给人类的生活带来了日新月
11、异的变化。纵观人类文明的历史长河， 生物科学技术的发展过程浓缩着人类生活的智慧精华。学习和了解生物技术的内容，可以使我们拓展、延伸和应用已有的生物学知识，拓宽科技视野。本模块内容主要包括发酵工程、细胞工程、基因工程以及生物技术的安全性和伦理问题，在各章内容中，同时安排了丰富的动手实践活动。通过本模块的学习，我们不仅能了解上述生物工程的一般原理和实施过程，还有机会通过实践活动亲自体验生物技术的应用价值。我们还会尝试提出初步的工程学设计构想，设计实践方案并进行实验，既能参与自制一杯美酒、腌制一罐腐乳，体验传统生物技术带给我们的美食享受，又有机会亲自克隆一种植物、体外扩增某一基因，感受现代生物技术的
12、神奇和其对人类生活的巨大影响。在本模块学习过程中，我们要做到以下几方面：努力提升自身理论联系实际的意识和能力，关注生活中的生物技术产品及其价值；应用已有生物学知识分析生物工程的理论和技术原理；积极主动进行实验设计并大胆进行实践尝试，在实验过程中积极思考，有所创新，认真撰写实验报告，讨论交流实验结果。科学技术是一把“双刃剑” ，生物技术的发展在为人类带来巨大利益的同时，也给人类带来了某些潜在的威胁和社会伦理问题，引起了各国政府和民众的高度关注和激烈争论。生物工程应在法律和伦理的约束下，以人类需求为目标进行产品的开发，进而推动生物学的不断进步，提高人们的生活质量。本模块内容在呈现各项生物工程的主要
13、原理和技术操作的同时，也从科学、技术、社会相互关联的角度，阐释现代生物科技对人类生活、生产和社会发展的影响，激发我们运用生物科技造福人类的兴趣和志向，同时关注和理性看待生物技术的利与弊。现代生物技术已渗透入我们生活的方方面面，不仅影响我们的物质生活，也在影响或改变着我们的价值观念。DNA不再只是科学家在实验室里的研究对象，转基因食品正逐渐进入人们的生活，基因水平上的疾病诊断和治疗呈现令人期待的应用前景。通过本模块内容的学习，相信同学们会尝试运用生物学的原理，面对健康、饮食、伦理、社会及环境安全等个人和社会问题，做出理性而科学的判断和决策。4目 录第一章发酵工程/1第一节微生物的培养需要适宜条件
14、/3第二节纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得/11第三节发酵工程为人类提供多样的生物产品/24本章小结/38第二章植物细胞工程/39第一节通过植物组织培养可获得完整植株/41第二节通过体细胞杂交可获得新的植物体/55本章小结/60第三章动物细胞工程/61第一节细胞培养是动物细胞工程的基础/63第二节通过细胞核移植克隆动物/69第三节通过细胞融合可产生具有新特性的细胞/77第四节对动物早期胚胎或配子进行处理可获得目标个体/85本章小结/961第四章基因工程/97第一节基因工程赋予生物新的遗传特性/99第二节基因工程及其延伸技术应用广泛/122本章小结/132第五章生物技术的安全与伦理/133第
15、一节转基因产品的安全性引发社会的广泛关注/135第二节我国禁止生殖性克隆人/142第三节世界范围内应全面禁止生物武器/147本章小结/1522利用发酵工程能以更加低廉的成本生产药物20世纪70年代，中国科学家屠呦呦及其研究团队在青蒿中发现高效抗疟疾药物青蒿素，并因此获得2015年诺贝尔生理学或医学奖。然而，植物中青蒿素含量较低，往往不能满足医疗需求。2013年，美国科学家成功利用经过基因改造的酵母菌，通过发酵工程，大规模工业化生产青蒿素的前体物质青蒿酸。这一发酵工程产品将使人们有可能以更加低廉的成本抗击疟疾。那么，什么是发酵工程呢？第 一 章发酵工程酵工程是采用现代工程技术手段，利用微生物的某
16、些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接利用微生物的工作过程。发酵工程中的主角是微生物，在发酵工程中，如何纯化、选育、培养目标微生物？除了一些药物以及人们食用的面包、酸奶、酱油、醋、腐乳等，还有哪些人类生产、生活需要的物质是通过发酵工程生产的呢？发学习目标1. 阐明使用无菌技术可获得纯净的微生物培养物。2. 概述分离和纯化微生物的平板划线法和稀释涂布平板法。3. 举例说明通过调整培养基的配方，可有目的地培养某种微生物。4. 概述测定微生物数量的稀释涂布平板法和显微镜计数法。5. 举例说明发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上有重要的应用价值。本章学习应聚焦的关键能力1. 认识无菌技术是获得纯净
17、微生物培养物的重要方法，尝试配制培养基培养酵母菌，学会无菌操作方法。2. 认识平板划线法和稀释涂布平板法是分离和纯化微生物的重要方法，尝试分离和纯化酵母菌，学会平板划线法和稀释涂布平板法。设计实验方案，有目的地培养某种微生物。3. 认识稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的重要方法，尝试分离和计数能分解尿素的微生物，学会稀释涂布平板法计数微生物。4. 认识传统发酵技术是生产某些食品的重要方法，尝试制作果酒、果醋和泡菜，学会传统发酵方法。第一章发酵工程微生物 （microbe） 是人们对所有形体微小、肉眼不可见的生物的统称。微生物种类繁多，分布广泛，在自然界中常杂居混生。在培养人们需要的
18、微生物即目标微生物时，一方面需要提供其适宜的生长环境，另一方面需要除掉与目标微生物具有竞争和寄生关系的异种微生物，这就需要一定的操作技术。在培养某种微生物时，防止其他微生物混入，保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术称为无菌技术（aspetic technique） 。那么，微生物的培养需要哪些适宜的条件？无菌技术又是如何实现无菌的呢？培养基为目标微生物提供适宜的生长环境我们养一只小猫或者小狗，不仅要给它喂食、喂水，也要考虑它的大小便等问题。培养微生物也一样，需要给它们提供生长所需的各种物质以及满足它们生长繁殖所需的各种条件。培养基（culture medium）就是人们为满足微生物生长繁殖
19、或积累代谢产物的需求而配制的混合养料。培养基的成分与细胞的化学组成及其在细胞代谢中的作用有关。水在细胞中的含量最高，也是细胞的重要组成成分。因此，培养基中含量最高的也是水。无机盐对于维持细胞的生命活动具有重要意义。在培养基中，无机盐含量的多少不仅会影响微生物细胞的吸水能力，也会影响微生物的代谢及生长。微生物构建自身有机物所需要的碳元素可能来自无机碳，如CO2，也可能来自有机物。这些为微生物生长提供碳元素的物质统称为碳源。培养基中还必须注意添加足量的含氮化合物，以便微生物能利用这些含氮化合物合成自身的蛋白质等有机物。这些为微生物生长提供氮元素的物质统称为氮源。由于自身的缺陷，有些微生物对培养基成
20、分有特殊的需求，需要在培养基中有针对性地添加某些特定的维生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶等有机化合物才能生长，这些化合物统称为生长因子 （growth factor） 。在满足微生物生长所需的各种物质的同时，还要考虑微生物生活所需要的能量来源。就异养型微生物而言，培养基中的有机物就能满足它们对能量的需求；对于自养型微生物而言，它们需要的是光能或者是化第一节微生物的培养需要适宜条件本节要点微生物培养基无菌技术接种3生 物 学选择性必修 3生物技术与工程学反应释放的能量。概括地说，培养基的成分中应包含微生物生长所需的水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。培养基的理化特性影响微生物的生长。不同的微生物代谢需求
21、不同，只有满足目标微生物的代谢需求，才能使其快速生长。 “细菌喜荤，霉菌喜素” ，是说细菌培养基中要含有较高的有机氮，因此常用蛋白胨和酵母提取物等来配制；霉菌培养基一般用可溶性淀粉加无机物配制，或用添加蔗糖的豆芽汁等配制。此外，细菌通常要求在中性偏碱的环境中生长，霉菌要求在中性偏酸的环境中生长，因此在制备培养基时要注意调节培养基的pH。根据培养基的物理特征可以把培养基分成液体培养基和固体培养基等。液体培养基（liquid medium）（图1-1A）是没有添加凝固剂的培养基，常用于大规模快速繁殖某种微生物。C. 固体斜面培养基B. 平板A. 液体培养基图1-1已灭菌的培养基固体培养基 （sol
22、id medium） 通常是在液体培养基中添加一定量的凝固剂制成的。由于细胞与固体培养基的接触面积较小，细胞与环境间物质交换速度相对较慢，培养基表面的微生物生长速度比在液体培养基中慢。将灭菌后未凝固的固体培养基注入培养皿中，冷凝后制成的固体培养基简称为“平板” （图1-1B） 。平板可以让人们清楚地观察到在培养基表面由单个细胞生长繁殖成的菌落，因此常用于微生物的分离、鉴定、活菌计数等。将灭菌后未凝固的固体培养基注入试管，将试管斜放在台面上，培养基冷却后在试管中形成了一个斜面，这样的固体培养基简称为“斜面” （图1-1C） ，常用于菌种保存（图1-2） 。4第一章发酵工程图1-2保存在斜面培养基
23、上的菌种实验室常用的LB（Luria-Bertani）液体培养基的组成见表1-1。表1-1LB液体培养基的组成成分营养物质水氯化钠蛋白胨酵母浸膏来源用动、植物蛋白制成的粉末状物质酵母细胞的水溶性提取物浓缩而成的膏状物质主要成分富含有机氮化合物，也含一些维生素和糖类富含B族维生素，也含有机氮化合物和糖类等根据培养基的化学成分可以把培养基分成合成培养基和天然培养基等。化学成分完全清楚的培养基称为合成培养基（synthetic medium） 。一般用于在实验室进行的、要求可重复性强的各种研究工作。用豆芽汁、椰子汁、稻草浸汁、牛奶等这些化学成分还不十分清楚或成分不恒定的天然有机物制成的培养基称为天然
24、培养基（complex me-dium） 。天然培养基与合成培养基相比成本较低，除了在实验室常用外，更多地被用于大规模的生物发酵工业。灭菌和无菌操作技术可以排除非目标微生物的干扰空气、水、培养容器甚至是培养基材料中都会含有各种微生物。为保证得到的培养物就是所需要的微生物，在培养过程中必须始终保持微生物培养物的种类单一，防止其他微生物混入。微生物细胞是由蛋白质、核酸等化学物质构成的，因此改变微生物所处环境的物理或者化学因素就可抑制微生物的生长甚至将它们杀死。例如，加热可以使蛋白质变性，波长在256266 nm的紫外线可使菌体的蛋白质和核酸变性，有很强的杀菌作用。保证器具与培养基无菌是获得微生物“
25、纯”培养物的基础。在实验室培养微生物的过程中，用来除掉各种微生物的简便易行的办法是加热。但某些种类的细菌会在营5生 物 学选择性必修 3生物技术与工程养缺乏或代谢产物积累的环境中形成没有繁殖功能的休眠构造，称为芽孢。芽孢的结构与细菌细胞不同，它在休眠期间不进行明显的代谢活动，因而对于加热、紫外线照射和化学药物都具有极强的抵抗能力。例如，热解糖梭菌（Clostridium thermosaccha-rolyticum）的细胞在50 下经短时间即被杀死，而它的芽孢在132 下约5 min后再置于适宜的条件下还有10%可能萌发。这就需要使用高压灭菌的方式来消灭器具和培养基中可能存留的各种类型的微生物
26、。使用高压灭菌锅灭菌时所需的温度、压力和时间是根据要消灭的微生物芽孢等结构的耐热性来确定的。如肉毒梭菌 （Botulinum） 能产生毒性极强的肉毒毒素，纯化结晶的肉毒毒素1 mg能杀死2亿只小鼠。肉毒梭菌的芽孢在pH7.0的100 沸水中要煮 5.09.5 h 才能被杀灭，当温度提高到 115 加压灭菌时，时间就能缩短到 1040 min，将温度提高到121 时只需要10 min就能完成。要保证外科手术器械无菌、安全，要在115 下灭菌30 min或在121 下灭菌10 min，这样才能杀死致病菌破伤风梭菌 （Tetani） 和产气荚膜梭菌 （Perfringens） 的芽孢。如此看来，在微
27、生物实验中用121 （1 kg/cm2压力）对实验器具和培养基进行1520 min的灭菌处理是比较安全的。灭菌后，要将高压灭菌锅中的实验用具及培养基及时取出。培养基放入超净工作台（图1-3） 。实验器具放入6080 的烘箱中烘干，除去灭菌时高压蒸汽产生的水分以免金属器械锈蚀。考虑到高压灭菌锅的使用效率，往往将培养基集中在一个较大的容器中放入高压灭菌锅灭菌。这样灭菌后的培养基不适于直接用来接种，需要分装到较小的培养容器中。因为空气中散布着许多微生物，所以分装最好在超净工作台内的酒精灯火焰旁完成（图1-4） 。在进行分装或接种操作前，将需要使用的、已灭菌的用具从烘箱中取出，放到超净工作台中，然后打
28、开紫外灯和过滤风开关，灭菌30 min。图1-3超净工作台图1-4在超净工作台中分装在分装时，应特别注意不要让培养基黏附在三角瓶口、试管口、培养皿内壁上，以免在培养过程中非目标微生物从瓶口沿器皿内壁上的培养基向内生长而发生污染。有些化合物在较高温度下会分解。例如，尿素受热会分解，葡萄糖在115 以上会6第一章发酵工程焦化。因此，采用已在121 下高压蒸汽灭菌的、孔径最小的G6玻璃砂漏斗对尿素、葡萄糖等进行过滤除菌后，再在超净工作台内添加到培养基中。对含葡萄糖的培养基，也可采用适当降低温度、压力（112 ，500 g/cm2）以及延长时间（30 min）的高压灭菌方法灭菌。实验中的废弃物存在对环
29、境影响的不确定性，通常为进一步降低培养物被污染的可能，对于接种间、培养间也应定期采用紫外线或药物熏蒸的方法进行灭菌或消毒。例如，培养基若被有害菌体污染，经繁殖后，大量有害菌体可能致病，也会污染环境。因此，在全部培养工作结束后，所有使用过的器皿、废弃物等都必须先经过高压灭菌后再洗涤或倾倒。小资料灭菌、消毒与防腐灭菌、消毒、防腐是实验室及生产生活中控制有害微生物常用的方法。灭菌是采用强烈的物理、化学方法杀灭物体表面以及内部的一切微生物的方法，如对器具和培养基进行高压蒸汽灭菌。消毒则是采用较温和的物理、化学方法仅杀死物体表面或内部一部分不需要的微生物。这种方法对被消毒的物体基本无害，如用消毒剂对皮肤
30、、水果或饮用水进行消毒。防腐是根据微生物生长繁殖的特点，通过控制理化因素抑制微生物生长繁殖的措施，如用除氧剂抑制需氧型微生物的繁殖，采用低温、盐腌、糖渍、干燥等防腐措施保存食物。接种过程中，防止其他微生物进入培养基是获得纯培养物的关键环节。将目标微生物转移到培养基中的过程称为接种。接种所使用的涂布器或接种环（图1-5）等工具均需灭菌后再使用。接种环涂布器图1-5接种工具7生 物 学选择性必修 3生物技术与工程用接种环接种前，要先将接种环的环部、金属丝、金属丝与柄的连接部、连接部的上端在明火上灼烧，使黏附在其表面的微生物在高温中炭化，待接种环冷却后再接种。在使用涂布器接种时，应将涂布器浸泡在75
31、%的酒精中。接种前将表面残留着少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上灼烧，冷却后用于涂布。瓶口或试管口是非目标微生物进入培养体系造成污染的通道。所以在接种过程中，打开塞子后和塞上塞子前都要将瓶口或试管口在酒精灯火焰上灼烧灭菌（图1-6） 。接种时要靠近酒精灯的火焰，利用燃烧产生的上升气流减少空气中微生物落入培养基的可能性。尽量减少各种器皿敞口向上的时间和机会，也能减少因非目标微生物落入而导致的污染。活 动配制可用于培养酵母菌的马铃薯蔗糖培养基酵母菌是我们在生活中发面、酿酒时常用的微生物。为了培养酵母菌，必须预先准备好酵母菌培养基。20%马铃薯蔗糖培养基的配方：去皮马铃薯丝 （或小块）20 g，蔗糖2
32、g，琼脂1.52 g，水100 mL（自然pH） 。目的要求配制液体培养基和固体培养基。材料用具马铃薯，蔗糖，琼脂，天平，试管，烧杯，三角瓶，培养皿，封口膜（或纱布） ，牛皮纸或报纸，橡皮筋，小刀，高压灭菌锅，玻璃漏斗，移液器等。方法步骤1. 计算：根据配方计算出配制培养基所需的马铃薯、蔗糖和琼脂的用量。2. 配制20%马铃薯浸汁：取马铃薯去皮，称取所需量，切成丝或小块，加水至所需量。用酒精灯加热煮沸10 min后，用纱布过滤到500 mL三角瓶中，按所需量加入蔗糖，待其溶化后补足水至所需体积，摇匀。3. 制备斜面、固体和液体培养基。液体培养基：将部分上述马铃薯浸汁分装到2个50 mL三角瓶中
33、，每瓶约图1-6对试管口灼烧灭菌8第一章发酵工程20 mL，封口。斜面培养基：按需要量称取琼脂，将其加入上述500 mL的三角瓶中，加热溶化后，用玻璃漏斗将培养基分装到2支18 mm180 mm的试管中，每支58 mL。操作提示：注意控制好温度，防止培养基提前凝固。不要让培养基粘在试管口。试管中的液体量约为试管长度的1/4。试管加棉塞后，用牛皮纸包好。固体培养基：将用于制备斜面培养基后剩余的培养基分装到250 mL三角瓶中，封口。将上述固体、液体和斜面培养基放入高压灭菌锅，在1kg/cm2、121 条件下灭菌20min，灭菌后将斜面培养基摆成斜面。4. 制作棉塞。用棉花制作试管棉塞时，要先确定
34、棉塞的长度和粗细。棉塞长度要保证既塞住瓶口（进入瓶口约34 cm） ，在瓶口外又要留有一定的长度（约2 cm） ，方便在接种时用无名指、小拇指取下来；棉塞粗细也要适当，以不易脱落为度。通常的做法：将棉花铺成一个一定厚度的棉花片，其直径是棉塞所需长度的3倍，然后沿直径的平行线对折一次，转90度后再向上折卷至形成一个棉塞（ 图1-7） 。若放入试管口感觉松，就需要打开已卷好的棉塞，向折叠处再添加棉花。做好的棉塞应上大下小，放入试管口后，周围应没有皱褶和缝隙，且容易拔出，但用手提棉塞时，试管又不能掉下来。值得注意的是，由于脱脂棉吸水后容易引起污染，所以制作棉塞应该使用普通棉花，而不能使用医用的脱脂棉
35、。A. 将棉花铺成圆片C. 折卷棉花片B. 对折后的棉花片D. 做好的棉塞图1-7棉塞的制作过程讨论1. 你认为生活中的哪些现象会使人联想到用马铃薯浸汁制备培养基？2. 本实验中，煮沸后的马铃薯浸汁为酵母菌的生长提供了哪些成分？3. 培养基中的琼脂能否成为酵母菌生长的碳源？9生 物 学选择性必修 3生物技术与工程与练习思考一、选择题1. 在微生物培养实验中，分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理方法，这些方法依次可用于杀灭什么部位的杂菌（）A. 接种环、手、培养基B. 培养容器、手、微生物菌种C. 培养基、手、接种环D. 培养容器、微生物菌种、接种环2. 在获得某种微生物纯净培养物
36、的过程中，操作的关键是（）A. 适宜环境条件下培养B. 接种纯种细菌C. 对所有器皿、培养基灭菌D. 用无菌水配制培养基3.“细菌喜荤，霉菌喜素”的意思是在配制培养基时（）A. 要调节培养基的pHB. 要考虑不同微生物的代谢特性C. 要调节培养基的渗透压D. 要考虑不同微生物的结构特性二、简答题1. 在全部培养工作结束后，所有使用过的器皿为什么必须先经过高压灭菌后再洗涤？2. 大肠杆菌在液体培养基和固体培养基中的繁殖速度是否相同？请说明理由。3. 生产实践中，在选择微生物发酵所需要的培养基原料时，往往以野生植物代替栽培植物、以秸秆代替淀粉、以非蛋白氮代替蛋白氮等。请说明利用上述培养基原料的优势
37、。10第一章发酵工程人们在研究或利用微生物时需要使用纯种。因为只有使用纯种才能保证实验的可重复性和结果的可靠性，才能保证产品的品质。所以，从混杂的微生物中分离得到目标微生物的纯种就成为培养微生物必须完成的任务。那么，如何从混杂的微生物中分离得到纯种的目标微生物？分离得到的纯种微生物的数量又如何去测定？采用划线或涂布的接种方法能够实现对目标微生物的分离和纯化接种是指微生物进入培养基质的过程。一杯牛奶暴露在空气中，会由于微生物落入、生长、繁殖而变质，在此过程中发生了自然接种。挑取目标微生物的纯种将其转移到液体培养基中培养，或在培养基斜面上连续划线用于保存菌种都是人为的接种。在固体培养基上采用划线或
38、稀释涂布的方法接种，通过培养能获得由一个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团，这样的细胞集团称为单菌落。平板划线法（streak plate method）接种时，通常用接种环蘸取液体培养物或挑取固体表面的微生物后，在固体培养基表面进行连续平行划线 （图1-8A） 、扇形划线（图1-8B）或其他形式的划线，以实现接种的目的。连续平行划线是从培养基上的一点出发，向左右连续划平行线至覆盖整个培养基表面。扇形划线是从培养基上的一点出发，向多方向多次划线，每划一条线都要将接种环在酒精灯的火焰上灭菌，然后再次从同一起点变换方向划线。多次连续平行划线接种时，划线可分34次进行。将培养皿旋
39、转一定角度后，不需再次蘸取菌种，只需在上一次划线的末端区域直接开始划线即可（图1-8C） 。第二节纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得本节要点分离纯化平板划线法稀释涂布平板法11生 物 学选择性必修 3生物技术与工程C. 多次连续平行划线图1-8平板划线的方法A. 连续平行划线B. 扇形划线（1）（2）（3）（4）划线的过程也是对菌种进行分散的过程，这样接种后经过培养，在划线的尾部就能得到单个细胞生长繁殖成的单菌落（图1-9） 。微生物细胞密集生长单菌落图1-9多次平行划线的培养结果稀释涂布平板法 （pour spread method） 接种时，通常需要先将菌液进行梯度稀释，并在培养皿侧面或
40、底面做好标记后，将稀释度不同的菌液各取0.1 mL，加在固体培养基表面，然后用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面上进行培养。这样在稀释度适当的固体培养基表面也能得到单个细胞生长繁殖成的单菌落（图1-10） 。根据菌落的形状、大小、颜色、边缘或表面光滑与否等特征可以选取目标微生物继续培养。12第一章发酵工程图1-10不同稀释度菌液的涂布结果需要计数的菌液稀释1 mL1 mL1 mL1 mL1 mL1 mL9 mL无菌水1/10（10-1）1/100（10-2）1/103（10-3）1/104（10-4）1/105（10-5）1/106（10-6）加入0.1 mL稀释液无法计数菌落数1591720
41、活 动接种、培养并分离酵母菌接种是使目标微生物在配制好的培养基上生长的操作。使用特定的接种技术可以在接种之后得到目标微生物的单菌落，实现对目标微生物的分离。目的要求1. 用平板划线法或稀释涂布平板法接种酵母菌。2. 用液体培养基大量扩增酵母菌。材料用具已活化的液体培养的酵母菌菌种或土壤悬液等其他样品液，无菌水，已灭菌的液体、固体和斜面培养基，培养皿，玻璃漏斗，移液器，接种环，涂布器，酒精灯，火柴，10 mL量筒，50 mL小烧杯，试管架等。13生 物 学选择性必修 3生物技术与工程方法步骤1. 制作平板。按图1-11所示方法对两个直径为90 mm的培养皿进行标记，分别向其中倒入未凝固的固体培养
42、基，使培养基铺满培养皿底部，厚度约2 mm。2. 接种。（1）用平板划线法接种。在用接种环蘸取菌液进行接种前，应在酒精灯火焰上从接种环的圆环处依次向上灼烧灭菌。为避免灭菌后接种环的高温烫死菌种，应在挑取菌种前将接种环贴在培养容器内壁上降温。初次划线时可参照培养皿底部的标记点进行划线，以保证有最好的划线分离效果。图1-11在培养皿底部做好标记（2）用稀释涂布平板法接种。如图1-12所示，在酒精灯旁涂布。操作提示：用无菌水对酵母菌菌液进行一定浓度的稀释。取0.1 mL的稀释菌液加入平板中央。在使用蘸有酒精的涂布器对平板中的菌液进行涂布时，应先在火焰上使酒精燃烧尽。此时手持涂布器的部位应高于火焰（图
43、1-13） ，以免酒精沿器具流下，烧伤手指。图1-13涂布器除去酒精图1-12在酒精灯旁涂布14第一章发酵工程（3）将菌种接种到液体培养基中。在无菌条件下用接种环将菌液接种到液体培养基中，同时以不接种菌液的液体培养基作为对照。3. 培养。将所有培养容器置于25 下培养24 h。4. 观察培养结果。获得单菌落后，可挑取菌落，并利用划线法接种至斜面培养基中。讨论1. 判断液体培养基成功接种酵母菌的依据是什么？2. 如何判断是否分离出酵母菌的单菌落？判断的依据是什么？3. 在固体培养基表面涂布的菌种是否出现形态、颜色不同的单菌落？你认为出现该现象的原因是什么？4. 仅从菌落特征是否能够认定你分离出了
44、酵母菌？怎样进行进一步的鉴定？稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量获得了目标微生物的纯种，就为深入研究这种微生物奠定了基础。接下来可能需要知道这种微生物的繁殖速度，但微生物的个体微小，很难直接观察到它们的数目变化。同时发现，平板上的菌落即使是分开的，也可能难以数清其数量。如果菌落太多，准确数出菌落数并不容易，这会导致最终的计算结果出现较大误差。而菌液稀释度过大，菌落数少，虽然容易准确计数菌落数，但可能存在较大的随机误差。要解决这个问题可以从两个方面着手：一是在保证能准确计数的前提下减小稀释度；二是将相同稀释度下的多组数值取平均值后再进行计算。即：每毫升菌液中微生物细胞的数量某一稀释倍
45、数下至少3个培养皿的平均菌落数菌液稀释液体积稀释倍数。例如，当向3个培养皿中依次添加0.1 mL稀释倍数为105的菌液后，3个培养皿中生长的菌落数依次为25个、32个、18个，计算过程为：（253218） 30.11052.5107个/mL。这样得到的数值可能更接近真实情况。有了前后两次对菌液稀释涂布的计算结果，就不难算出这种微生物的繁殖速度了。借助于显微镜、血细胞计数板也能在显微镜下直接对菌液中的酵母细胞进行计数。图1-14是一种较常用的血细胞计数板。15生 物 学选择性必修 3生物技术与工程XB.K.25.0.10mm1/400mm2量制沪字02270113号MCQIUJING图1-14血
46、细胞计数板血细胞计数板由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成。玻片中部有四条下凹的槽，将玻片中部分割成三个平台。中央平台比两侧平台低0.1 mm（图1-15） 。图1-15血细胞计数板侧面观血细胞计数板盖玻片中央平台凹槽中央平台又被一短横槽分成上、下两个部分。中央平台上、下两个部分各刻有一个计数区。在显微镜下可以看到计数区由长、宽各1 mm的9个大方格组成（图1-16） 。每个大方格面积为1 mm2。因为中央平台比其两侧的平台低0.1 mm，所以盖玻片下每个大方格内的液体体积1 mm20.1 mm0.1 mm3。由于血液中的白细胞相对于红细胞数量少、体积大，故计数区正中间的大方格为红细胞计数区，四
47、角的四个大方格是白细胞计数区。红细胞计数区又用双线分成25（或16）个中方格，每个中方格再用单线划分为16（或25）个小方格。16第一章发酵工程注： 蓝色框： 一个大方格橘色框： 一个中方格绿色框： 一个小方格白细胞计数区1 mm图1-16计数区的划分用显微镜进行酵母细胞计数时，应先将专用的盖玻片盖在计数板上，再用吸管在中央平台盖玻片边缘滴加摇匀的酵母菌悬液（图1-17） ，让菌液渗入盖玻片下直至充满计数区。滴加菌液时，一方面要避免菌液滴到盖玻片上，另一方面要注意防止产生气泡，以免影响计数结果。于盖玻片边缘滴加菌液盖玻片图1-17在计数板上加入菌液考虑到酵母细胞的体积和数量，在显微镜下计数酵母
48、细胞可在红细胞计数区进行。红细胞计数区内的小方格为计数提供了方便，但总计400个小方格的计数工作量较大，此时应依据统计学的随机取样原则进行取样来统计酵母菌的细胞数。对有25个中方格的红细胞计数区可采用“五点取样” ，即选取四个角和正中央的五个中方格（总计80个小方格）进行细胞计数。采用“五点取样”时，虽然事先确定了计数的区域，但酵母细胞在中间和四个角上的方格中出现的概率是随机的，所以仍能满足随机取样的要求。17生 物 学选择性必修 3生物技术与工程小资料随机取样原则当人们面对工作量巨大的一项调查工作时，取样调查是尽快获得可靠调查数据的常用方法。由于调查对象数量巨大，把调查对象划分为若干调查单位
49、有利于调查工作的开展。每个调查单位就是取样时可能抽取到的样本。在抽取样本时要排除人的主观意愿来抽取调查单位，保证总体中的每个样本被抽到的概率均等，这就是随机取样原则。在计数每一小方格中的细胞数时，为了避免重复计数压在小方格边缘线上细胞的数目，应只计数每一小方格上方和左侧线条上的细胞数（即“数上不数下” “数左不数右”） 。为了保证结果的可信度，消除误差，应对同一红细胞计数区中的细胞数进行3次计数后取平均值，再按比例进行换算。因为红细胞计数区的液体体积为0.1 mm3，所以按下列公式计算就可得到每毫升菌液中的酵母细胞数：酵母细胞个数/mL80个小方格细胞总数/8040010000稀释倍数调整培养
50、基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物不同自然环境中生活着的微生物代谢类型不尽相同。有些微生物不需要以现成的有机物为食，它们能利用光能（如蓝细菌和藻类）或无机物氧化释放的能量将CO2转变为有机物。有些微生物需要以现成的有机物为食，如大多数细菌、真菌和原生动物。有些微生物为需氧型，有些微生物则是厌氧型。有些微生物能固氮，而大多数微生物不能以N2作为氮源。有些菌株由于突变或经人工诱变后丧失了合成某种特定化合物的能力，必须从外界环境获得该物质才能生长繁殖。许多微生物的代谢方式并不唯一。某些异养型微生物在有有机物存在的情况下可同时将CO2转变为自身的物质，它们只是不以CO2为唯一（或主要的）碳源。
