1、高二生物 编号：SWXX116教师批阅定等血红蛋白的提取和分离导学案（二）编写：王楚松 审核：高二生物组 包科领导：李新华 班级： 组别： 姓名： 【学习目标】1、能记住蛋白质的提取和分离的步骤； 2、能进行凝胶色谱操作；【学习重难点】重点：蛋白质的提取和分离的步骤、凝胶色谱操作 难点：凝胶色谱操作【学习过程】引入：前次课我们学习了分离蛋白质的基本方法。而血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2的运输。在本课题中，我们将以血红蛋白为实验材料，学习蛋白质的提取和分离的一些基本技术。知识点一：知识回顾（查阅资料，小组讨论）1、血红蛋白主要存在于 （细胞）中，其特征元素是 ，其
2、主要功能是 。 2、细胞的基本结构包括 、 和 。3、是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法是 。分离的原理是：当不同的蛋白质通过凝胶时， 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ；而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。4、电泳能够使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离，其中在测定蛋白质的相对分子质量时通常使用 （方法）。知识点二：实验设计样品处理及粗分离（阅读教材P6667相关内容）1、蛋白质的提取和分离一般分为四步： 、 、 和 。2、血红蛋白由 肽链组成，包括两个 和两个 。每条肽链环绕一个 基
3、团，此基团可携带 或 。血红蛋白因含有血红素而呈现 。 3、红细胞的洗涤： 目的：去除 。方法： 离心，如500 rmin离心2 min，然后用胶头吸管吸出上层透明的 ，将下层 的红细胞液体倒入 ，再加入 的生理盐水，缓慢搅拌 ，低速短时间离心，如此重复洗涤 ，直至上清液中不再呈现 ，表明红细胞已洗涤干净。 注意：洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数太少，则 ；离心速度过高和时间太长会使 ，达不到分离的效果。4、血红蛋白的释放：将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加 到原血液的体积，再加40的 ，置于 上充分搅拌10 min。在蒸馏水和甲苯的作用下， 破裂，释放出 。5、分离血红蛋白溶液：将
4、搅拌好的混合液离心后可观察到试管中溶液分为4层。第1层： 的甲苯层第2层： 的沉淀层 薄层固体第3层： 的水溶液 透明第4层：其他杂质的 色沉淀物 将液体用 过滤，除去 ，于 中静置片刻后，分出下层的 液体。6、透析：过程：取1 mL的 溶液装入 中，将其放入盛有300 mL的20 mLL的 中（pH = ），透析12 h。原理：透析袋能使 自由进出，而将 保留在袋内。目的：可以除去 ，或用于 。想一想2： 1、红细胞的洗涤过程中加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？练一练2： 1、洗涤红细胞时，分离所用方法为（ ）A、低速成长时问离心 B、低速短时间离心C、高速长时
5、间离心 D、高速短时间离心2、蛋白质的提取和分离分为哪几步（ ）A、样品处理、凝胶色谱操作、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳B、样品处理、凝胶色谱操作、纯化C、样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定D、样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定3、为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂 。（）A、 NaCl B、甲苯 C、蒸馏水 D、柠檬酸4、将经处理破裂后的红细胞混合液以2000 rmin的速度离心10 min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是（ ）A、血红蛋白、甲苯层、脂类物质层、沉淀层B、甲苯层、沉淀层、血红蛋白、脂类物质层C、脂类物质层、血红蛋白、甲苯层、沉淀层D、甲苯层、脂类物质层、
6、血红蛋白、沉淀层知识点三：实验设计凝胶色谱操作（阅读教材P6769相关内容）凝胶色谱操作包括以下步骤：1、 ：2、凝胶色谱柱的装填：装填写前要将色谱柱垂直固定在 上。本实验使用的是 （Sephadex G75）。“G”表示 ，75表示 。注意色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须 。装填完后，立即连接 ，在约50cm高的操作压下，用300mL的20mmol/L的 （PH= ）充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。3、样品的加入和洗脱：调节缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝 胶面平齐，关闭出口。加入蛋白质样品：用吸管将透析后的样品沿管壁环绕移动加到色谱
7、柱的顶端。加样后， 打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全渗入凝胶层后， 关闭出口。调节缓冲液面：加入20mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度洗脱：连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。收集分装蛋白质：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集。想一想3：1、沸水浴处理加入洗脱液的湿凝胶的目的是 。装填完后，立即用洗脱液洗脱的目的是 。2、你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？3、在装填凝胶柱时，为什么不得有气泡存在？4、如何证明色谱柱制作成功？练一练3： 凝胶色谱法分离蛋白质中使用的凝胶是交联葡聚糖凝胶（Sephadex G一75），其中G75的含义为（ ）A、G表示凝胶的使用量，75表示加25 g水 B、G表示凝胶的交联程度，75表示需加热到75C、G表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示每克凝胶膨胀时吸水7.5gD、G表示凝胶的膨胀体积，75表示每克凝胶膨胀时体积可达75cm3【课堂小结】【课后反思】本节课我最大的收获是 我还存在的疑惑是 我对导学案的建议是
