1、 第一部分 2 DNA双螺旋 1953 中心法 1958 PCR 1983 DNA重 技1974 密 1966 DNA是 物 1952 1950200019901980197019602010 第一台自 序1986 毛管泳 序1996 光ddNTP 第一台商用 自序 1987 化学降解法和 sanger 1977 Illumina 2006 3700 1998 Solid system 2007 454 2005 Heliscope 2008 Gexp 2010 Ion pgm 2010 Nanopore 2008 Smrt 2009 第一部分 3 第一代基因序技 1977年桑格定了第一个基因
2、序列，是噬菌体X174的，全5375个碱基 在2001年，完成的首个人基因 就是以改了的Sanger法其序基 1.1975年由（Sanger）和（Coulson）开创的双脱氧链终止法 2.1977年吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解） 3.在sanger法基上展而来的各种DNA序技 第一部分 4 Sanger法的原理 1.使用有放射性同位素的ddNTP来止DNA合成反 2.高分辨率性凝胶泳以及放射自影确定DNA序列 核心原理： 1.序度可达1000bp 2.准确性高，几乎100% 3.通量低，成本高，耗，不适合大模用 特点： Sanger法核心原理 第一部分 5 第一代序技在分子生
3、物学研究中 重要的作用,如人基 因 划(human genome project,HGP)主要基于第一代DNA序技 。目前基于光 和Sanger的双脱氧 止法原理的光自 序 仍被广泛地用。 随着人基因 划的完成,人 入了后基因 代,即功能基 因 代, 的序方法已不能足深度序和重复序等大 模基因 序的需求,促使了新一代DNA序技的生，即第二 代序技。 第二部分 6 第二代基因序技 核心原理：合成 序（SBS） 基本步：文制克隆DNA簇的生序反 第二部分 7 具代表性的第二代序平台： 1.光 -美国Illumina 公司的基因 序（genome analyzer，GA） -瑞士Roche 公司的4
4、54 -美国ABI 公司的寡聚物接 序（sequencing by oligo ligation detection， SOLiD） 第二代基因序技 2.PH变化 -美国Life Technologies 公司的Ion Torrent个人化操作基因组测序仪(PGM） 第二部分 8 Illumina序平台 美国Illumina 公司的基因 序（genome analyzer，GA） Illumina的Solexa和Hiseq是目前全球使用量最大的第二代序机器 主要技点： 1.可逆止的光dNTP 2.合成序 第二部分 9 Illumina序平台序原理 文构建 SBS序式pcr Flowcell 序
5、原理（来自illumina官网） 第二部分 10 Illumina序平台核心部件 序流槽flowcell：吸附流DNA片段的槽道，也是核心的序反容器在flowcell上行DNA 簇的生成，序。 Flowcell物 第二部分 11 Flowcell表面示意（来自illumina官网） 每个泳道(Lane)内的上下两个表面随机的布了能与文两端接分 互配的寡核苷酸(P7和P5接)。两种接与泳道表面共价接。 Flowcell表面微示意 第二部分 12 DNA文制 A A T T 片段化DNA 末端平 3加A： 加一个A 接接 A 完成文构建 第二部分 13 DNA模板交和一合成 5-3 延 伸 接序列
6、 含有P7和P5两种接 的FlowCell表面 2.以交的DNA模板， FlowCell上的接引物， 合成第一 1.DNA分子与FlowCell表面 的接交 第二部分 14 双DNA性 性 冲走模板 新和成的留在flowcell 上 第二部分 15 式PCR的增 DNA与FlowCell表面 接交，形成“” 以接引物行增 增完成形成双的 第二部分 16 双DNA性 性 得到与FlowCell相的两 条互的DNA分子 第二部分 17 待形成 完成数十次循的式PCR 性：双“”性 P5上的切割位点 切割并冲走与P5接相的那条 DNA 将序引物交到文的接上， 并且封3-OH端 第二部分 18 SBS
7、序 特异光的4种dNTP，3-OH叠氮基被保，每次只能添加一个dNTP，就确保了在序 程中，一次只会被添加一个碱基，最后利用算机分析将光学信号化序碱基。 合成序（来源：illumina官网） 第二部分 Ion Torrent PGM半体序 PGM序原理 芯片就是序，4种dNTP依次流半体芯片PCRDNA聚合生的离子直接，每 个碱基只需数秒 18 第二部分 20 序成本比 1.高通量，成本降低，敏感性高 2.快速自化 3. 短50-300bq左右 4.PCR可能引入偏倚跟配 如： 以前完成一个人基因 的序需要3年，而使用 二代序技 需要1周。 第二代序技特点 第三部分 第三代序技 21 具代表性
8、的第三代序平台： 1. Pacific Bioscience 公司的分子 序(Single molecule real time sequencing，SMRT) 2. Oxford Nanopore 的米孔分子技 第二代的高通量序技已得到了很好的展和用, 但是由于其序速度、成 本、准确度等关 的解决仍存在困,研究者很快将目光向了更高更新的序解决 方案。 分子序也就运而生。 第三部分 22 Oxford Nanopore米孔分子技 Oxford Nanopore 的米孔分子技 Oxford Nanopore 的米孔分子技采用解 序的方法。无需合成，真正的分子序。 当DNA模板会被核酸外切酶剪切成一个个碱基通米孔，此由于碱基的不同，到的流 强度也不同，反映出DNA模板的碱基排布。 第三部分 Oxford Nanopore米孔分子技 MinION 英国Oxfold Nanopore Technologie公司已推出高通量的GridION （2012 年） 和U 大小的MinION （2013年）序，它均于用段。 22 第三部分 24 第三代序技特点 1.在第二代基上增加，达 到5000bp以上，甚至数十kb 2.分子序，品理避 免了增可能引入的配，准确 率接近100% 3.能直接RNA和甲基化DNA序 列行序
