1、动物细胞融合 肿瘤细胞 肿瘤细胞使来自于肿瘤组织的细胞或经肿瘤细 胞与其它细胞融合产生的细胞，如杂交瘤细胞 。与转化细胞相比，它们是恶性的，基本上是 非贴壁依赖性的。肿瘤细胞有很好的增殖特性 ，生长速率高。对生长因子的依赖程度低，对 培养环境的要求也不那么苛刻。 肿瘤细胞的致癌性是造成其难以用于体内治疗 产品生产的主要原因。由于近年来分离纯化技 术的进步和对这些细胞致瘤性的深刻认识，对 其在生产中的应用有所松动，如杂交瘤细胞生 产的单克隆抗体已用于体内治疗，C127细胞生 成重组蛋白的研究也形成了规模。 动物细胞培养 单克隆 抗体 由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆）， 形成基因型相同的细胞群
2、，这一细胞群所 产生的化学性质单一、特异性强的抗体称 为单克隆抗体。 特点：特异性强、灵敏度高 杂 交 瘤 技 术 培养基 培养基配置考虑的因素的 pH 多数细胞系在pH7.4下生长得很好。 一些正常的成纤维细胞系以7.47.7最好，转 化细胞系以pH7.07.4更合适。 缓冲 在高细胞密度下，转化细胞系产生大 量二氧化碳和乳酸，引起pH下降，需要在培 养基中加入缓冲作用的试剂，如碳酸氢钠、 HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸N-2- Hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid ) 典型过程培养 动物细胞培养 温度 低温下CO2溶解
3、度增加 ，引起pH变化。 黏度 培养基的黏度主要受 血清含量的影响。在搅拌条 件下黏度大则细胞受损伤小 。加入羧甲基纤维素或聚己 烯基吡咯烷增加培养基黏度 典型过程培养 动物细胞培养 细胞培养基的基本组成 1、水 细胞培养用的各种液体都要用水来配置，对水 的纯度要求很高。通常细胞培养用水的污染物 标准可参考医药上注射用水标准，单原则上应 高于注射用水标准。 2、能源和碳源 主要是糖和糖酵解的产物和谷氨酰胺。细胞能 用的糖主要是六碳糖，特别是葡萄糖。葡萄糖 很容易被大多数细胞转化为乳酸。昆虫细胞更 偏爱蔗糖。在多数培养基中谷氨酰胺作为主要 的能源和碳源。使用谷氨酰胺最大的问题是它 的自发降解，降
4、解量与时间、温度、血清和磷 酸浓度有关，降解产物为氨，对细胞有毒性。 典型过程培养 动物细胞培养 3、氮源 氨基酸是组成蛋白质的基本单位，也是细胞 合成复杂含氮化合物的前体，还作为必不可 少的能源物质。不同种类的细胞对氨基酸的 种类和浓度有不同的要求，但除了前面提到 的谷氨酰胺外，还有12种氨基酸不能在细胞 内合成，必须依靠从培养基中摄取。几乎所 有培养基中都含有全部必须氨基酸，根据需 要补充适量非必需氨基酸。非必须氨基酸含 量低时常会增加必须氨基酸的消耗量。增加 氨基酸的浓度可以提高培养的细胞密度和产 物产率。 典型过程培养 动物细胞培养 4、维生素 维生素是维持细胞正常生理状态的一种重要
5、生物活性化合物，在细胞中多形成酶的辅基 或辅酶，对细胞的代谢过程有重要影响。 5、无机离子 无机离子分为两组，一种是含量较高的， 包括维持膜电势的（Na+，K+），维持渗透压 平衡（Na+，Cl），作为酶的辅因子（Mg2+ ），促进细胞贴附（Mg2+Ca2+），起缓冲作 用（HPO42-，HCO3-）；另一种势微量元素 ，如铁、锰、锌、钼、硒、钒、铜。 典型过程培养 动物细胞培养 6、脂类和磷脂前体 在使用血清的细 胞培养中，脂类来自血清，在无血清培 养中，有些细胞需要添加脂类，如胆固 醇、脂肪酸、磷脂。特别是缺陷型细胞 ，对某种脂类有很高的依赖性。 非营养性物质 1、抗生素 细胞培养中，特别
6、是原代细胞培 养中，常使用抗生素抑制微生物的污染。 2、pH缓冲剂 最常用的缓冲剂是碳酸氢钠， 常用浓度26mmol/L，接近血中浓度，必须与 510CO2平衡，否则培养基迅速变碱。 HEPES是缓冲能力很强的化合物，但由于它 相当昂贵，细胞大规模培养中很少使用。 典型过程培养 动物细胞培养 3、酚红 酚红普遍作为培养基的pH指示剂 4、保护剂 细胞保护剂指保护细胞免受由渗透压变化、剪切、 毒性金属和氧化剂所引起的损伤的物质。在生物反 应器中培养的细胞会受到机械搅拌和气泡运动所产 生的剪切损伤，某些大分子化合物，如甲基纤维素 、葡聚糖、PEG、聚乙烯吡咯烷酮、Pluronic F68 、血清白
7、蛋白，能够减轻这种损伤。 5、还原剂 某些还原剂在细胞培养中有特殊作用。巯基乙醇 在杂交瘤细胞培养中能刺激抗体分泌，并促进胱氨 酸利用。 典型过程培养 动物细胞培养 血清 常用的血清是小牛血清、胎牛血清、马 血清和人血清。最常用的是小牛血清。 血清是极其复杂的混合物，含有食物物 质、代谢物、激素、血浆蛋白、破碎细 胞释放物质、采血中引入的污染物。由 于历史原因，商业培养基大都是按添加 血清来设计的，使用血清技术也很成熟 ，尽管使用血清有许多缺点，仍将其作 为细胞培养最重要的添加剂普遍采用。 典型过程培养 动物细胞培养 三、细胞计数及活力测定 培养的胞在一般条件下要求有 一定的密度才能生良好，所
8、以 要行胞数。数果以每 毫升胞数表示。胞数的原 理和方法与血胞数相同。 典型过程培养 动物细胞培养 在胞群体中有一些因各种原因而死亡的胞 ， 胞中活胞所占的百分比叫做胞活力 ，由 中分离胞一般也要 活力，以了 解分离的程 胞是否有 作用。复后 的胞也要 活力，了解存和复的效果 。 用台盼染胞，死胞着色，活胞不着色 ，从而可以区分死胞与活胞。利用胞内某 些酶与特定的 生色反，也可定 胞相数和相活力。 典型过程培养 动物细胞培养 四、培养物的污染及防止 染途径 1 空气：空气流性大，如果培养操 作地于外界隔离不格或消毒不充 分，外界不空气很容易入造成 染。因此，培养施不能在通 所。无菌操作在化台内
9、行，工 作要口罩 典型过程培养 动物细胞培养 2 器材：各种培养器皿 3 操作： 操作无菌念不强，技不熟 ，使用染的器皿或封瓶不等，都可以 造成染。 4 血清：有些血清在生 就已被支原体 或病毒等染，成了染。 5 本：原代培养的染多数来源于 本；取材碘酒消毒后脱碘不底，可 造成碘混入 ，胞或培养液中，影响 胞胞生。 典型过程培养 动物细胞培养 五、动物细胞的大规模培养 （一）培养环境 1、温度 温度是细胞在体外生存的基本条件 之一，来源不同的动物细胞，其最适的生长温 度不同。例如昆虫细胞的 最适温度是25 280C，人和哺乳动物细胞的最适温度是370C ，细胞代谢强度与温度成正比，超出最适温度
10、 范围，细胞的正常代谢和生长将会受到影响， 甚至导致死亡。 典型过程培养 动物细胞培养 2、pH 大规模培养时影响培养液的pH稳定性的主要因 素有三种： （1）缓冲液的缓冲能力及种类 （2）对流空间大小 （3）葡萄糖浓度 培养液中正常的缓冲系统是NaHCO3/CO2系统 ，它是一种弱缓冲系统，其pK为6.1，低于生理 学最佳要求。这种缓冲系统要求在培养液上面 的对流空间加入CO2以防止它的丢失及增加羟 基离子。 典型过程培养 动物细胞培养 也可使用磷酸缓冲液，但磷酸对动物细胞 有毒害作用。HEPES生物缓冲剂也曾被加 入NaHCO3/CO2缓冲系统中，这是由于 HEPES的pK为7.0，HEP
11、ES被加入后，其 缓冲能力为pH6.87.2。但是当HEPES 浓度高于25mmol/L时，它对大多数动物细 胞都有毒害作用。 动物细胞大规模培养时常有几种方法来调节 培养液中的pH： （1）在培养基中添加NaHCO3作为缓冲剂 及通入含CO2的空气进行调节 典型过程培养 动物细胞培养 （2）用0.1mol/LNaON或0.1mol/LHCl进 行调节。由于动物细胞培养时要求低搅拌 和弱混合，利用NaOH或HCl进行调节时 会发生局部过酸或过碱的现象，从而对细 胞产生毒性作用，因此这种调节方法在动 物细胞培养时不太合适。通常通过调节培 养基中NaHCO3用量及通气中CO2浓度来 控制发酵过程的
12、pH。 典型过程培养 动物细胞培养 3、溶解氧 大规模培养中如何提供足够的 氧是非常重要的。通气得得目 的有两个：一是提供细胞代谢 所需的足够的氧；二是使发酵 液处于均匀悬浮状态，有利于 传质过程。 典型过程培养 动物细胞培养 （三）培养容器 1、多孔板、Petri培养皿和组织培养方瓶都是常 用的静止培养容器，体积小，操作方便，很容易 放入培养箱内培养。 2、滚瓶 也是一种重要的培养容器，培养时放在 滚瓶机上缓慢滚动，但培养条件很接近于静止培 养。它体积交大，接种后放入温室或专门的培养 箱中培养。培养依赖性贴壁培养细胞时，需加入 微载体以增加培养表面积。 3、生物反应器是大规模培养中最重要的培
13、养设 备。它有各种不同形式，容积可以从1升到几十 立方米。 典型过程培养 微载体 微载体是指直径在60250m、适合于动物细胞贴 附和生长的微珠。微载体法培养动物细胞有很多好 处;可在反应器中提供大的比表面积可采用均匀 悬浮培养，简化了各种环境因素的检测和控制，提 高了培养系统的重演性可用普通显微镜观察细胞 在微载体上的生长情况容易放大适合于多种贴 壁依赖性细胞培养容易收获细胞。微载体培养系 统的缺点是：细胞生长在微载体表面，易受到剪 切损伤，不适合贴壁不牢的细胞生长微载体价格 较贵，一般不能重复使用需要较高的细胞接种量 。 典型过程培养 悬浮培养 悬浮培养指细胞在培养容器中自由悬浮生 长的过
14、程，主要用于非贴壁依赖性细胞的 培养，如杂交瘤细胞等。动物细胞悬浮培 养与微生物过程比较接近，但由于动物细 胞对搅拌和通气造成的流体剪切很敏感， 在反应器的设计和操作上又有特殊要求如 利用螺旋带叶轮减小生物反应器培养过程 中的剪切作用，并通怀愀笀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀活5gwap前台访问/BookRead.aspx?id=1522880106.11.152.1160硹翽遠最搀栀琀洀氀礂艸擄洼怀/Mg前台访问/p-2075141.html106.11.158.360匀欀眀愀瀀瀀栀琀洀氀礂艸擄洼怀鱐/Ic前台访问/p-45156.html42.156.137.160翟茀鼀挀栀琀洀氀搀洼5Skw
15、ap前台访问/p-1279709.html116.198.10.90燲愀笀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀退洽/Ke前台访问/p-385989.html106.11.153.850莴开礀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀退洽砀/w前台访问/BookRead.aspx?id=4515642.156.138.160莴开礀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀适洽怀/Ie前台访问/d-53844.html182.38.124.1430旉翽遠愀笀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀派怀/Mg前台访问/d-1267746.html42.156.136.370匀欀眀愀瀀瀀栀琀洀氀派怀/Ke前台访问/p-115873.html42.156.1
16、38.410最搀栀琀洀氀派砀/_y前台访问/BookRead.aspx?id=387750106.11.158.400莴开礀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀餂呻派怀/Mi前台访问/p-1257234.html156.224.69.1940燲攀瀀栀琀洀氀洿怀/Mg前台访问/d-1976688.html119.121.4.1090旉翽偠颜挀搀栀琀洀氀洿怀/Mg前台访问/p-1663606.html106.11.155.390愀笀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀流砀/w前台访问/BookRead.aspx?id=42598106.11.155.470匀欀眀愀瀀瀀栀琀洀氀流/_y前台访问/BookRead.asp
17、x?id=14673942.120.160.810眣匀欀眀愀瀀瀀栀琀洀氀流/u前台访问/c-00015-8-57075-0-0-0-0-9-0-2.html220.186.85.730最瀀栀琀洀氀礂艸浂怀鱐/Ie前台访问/d-21938.html106.38.241.1190硹翽偠颜愀笀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀浂抲5Skwap前台访问/p-1279708.html116.198.10.70开笀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀氀浃褀抳/y前台访问/c-00011-957-40959-0-0-0-0-9-0-1.html114.98.189.2270眢蓒愀紀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀浅璮/a前台访问/
18、BookRead.aspx?id=2092894106.11.158.750匀欀眀愀瀀瀀栀琀洀氀一浅璮/w前台访问/BookRead.aspx?id=21620106.11.157.370繴愀笀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀倀浈5Skwap前台访问/p-1279711.html116.198.15.20摩翽灠撀椀瀀栀琀洀氀刀浉/a前台访问/BookRead.aspx?id=1219050106.11.155.1040开礀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀吀浉5Sowap前台访问/p-1549638.html183.162.168.160匀漀眀愀瀀瀀栀琀洀氀嘀琀浊5Sowap前台访问/p-1504974.h
19、tml180.138.55.1830勈珼潇最茀眀愀瀀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀堀测5Skwap前台访问/p-1279728.html116.198.10.90硙翽灠撀最瀀栀琀洀氀娀礂艸浍怀鱐/Kc前台访问/p-612863.html182.32.66.850硹翽遠椀瀀栀琀洀氀尀餂罹浏怀/Mg前台访问/p-1533619.html157.55.39.1190禙偐翽遠最瀀栀琀洀氀帀倖浐怀僰5Sqwap前台访问/d-1565111.html125.122.118.2260禙兼翽遠椀搀栀琀洀氀怀浒5Sowap前台访问/p-2022413.html110.85.186.2530禙动翽遠最瀀栀琀洀氀戀餂呻
20、浒怀/Ke前台访问/p-175589.html157.55.39.1540禙叔翽遠椀搀栀琀洀氀搀餂呻浓怀/Mk前台访问/p-2055040.html182.244.169.1890焵嘬挀眀愀瀀漀最椀渀愀猀瀀砀昀堀浗5Smwap前台访问/p-1279697.html116.198.10.100箙坘翽椀瀀栀琀洀氀栀餂呻萶浘怀/Ki前台访问/p-177396.html114.223.165.2360禙墄翽遠最瀀栀琀洀氀樀餂呻萶浘怀/Mi前台访问/d-1861229.html122.242.134.120箙嫜翽椀瀀栀琀洀氀%笀錀挀栀琀洀氀豳淵/Gc前台访问/i-3017.html60.167.103.
21、1370礹翽最瀀栀琀洀氀淶怀/Me前台访问/d-1135870.html27.40.109.940礹翽最瀀栀琀洀氀混怀/Mi前台访问/p-1283173.html182.110.208.480礹翽最瀀栀琀洀氀淹/Gc前台访问/n-3017.html60.167.103.1370礹翽最搀栀琀洀氀淺/So前台访问/sitemap-1692.html45.195.222.2340礙翽最瀀栀琀洀氀一格添怀/Mi前台访问/p-1493923.html216.244.66.2000匀焀眀愀瀀瀀栀琀洀氀倀鐟淼怀/Ke前台访问/p-104634.html157.55.39.1190昉翽挀瀀栀琀洀氀刀鐀淼5gw
22、ap前台访问/BookRead.aspx?id=2026735110.249.201.1580昉翽最瀀栀琀洀氀吀淽怀/Mi前台访问/p-1279371.html123.129.17.1620昉翽最瀀栀琀洀氀嘀瀟渂怀/Ke前台访问/p-102162.html207.46.13.2000礹翽攀瀀栀琀洀氀堀鰟渃怀/Ke前台访问/p-176474.html207.46.13.2000眣攀瀀栀琀洀氀娀渄怀/Me前台访问/p-2054901.html113.75.0.2120昉翽最瀀栀琀洀氀尀渇怀詰/Ic前台访问/p-26772.html40.77.167.1720昉翽攀瀀栀琀洀氀帀渋怀/Mi前台访问/p
23、-2048189.html183.162.168.160昉翽欀搀栀琀洀氀怀渋怀/Ga前台访问/n-1012.html157.55.39.1540昉翽攀搀栀琀洀氀戀渌怀/Ke前台访问/p-135766.html157.55.39.1540昉翽最瀀栀琀洀氀搀吟渏怀/Mi前台访问/d-1297962.html106.38.241.1190昉翽最瀀栀琀洀氀昀。耈渐蠀諾/So前台访问/sitemap-3075.html45.195.222.2340昉翽挀瀀栀琀洀氀栀渕5Sqwap前台访问/p-1984593.html110.249.202.1790最蔀眀愀瀀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀樀尟渖怀/Ig前台访
24、问/p-56317.html111.178.215.1430昉翽攀瀀栀琀洀氀氀蠼渗怀/Mc前台访问/d-2076735.html49.86.62.390眣椀瀀栀琀洀氀渀渙/a前台访问/BookRead.aspx?id=1679720157.55.39.1540礹翽椀瀀栀琀洀氀瀀摱渝/u前台访问/c-00016-10-6956-0-0-0-0-9-0-0.html202.110.10.1970礹翽最瀀栀琀洀氀爀渟怀/Mg前台访问/p-1546955.html117.60.39.1240昉翽最瀀栀琀洀氀琀渣/a前台访问/BookRead.aspx?id=1640179157.55.39.1190昉
25、翽愀瀀栀琀洀氀瘀氼渤怀/Ic前台访问/p-32340.html157.55.39.1190%脀鬀挀栀琀洀氀砀餂罹氟渤怀/Ie前台访问/p-20946.html60.189.108.1060匀漀猀椀琀攀洀愀瀀栀琀洀氀稀舂汷渤/s前台访问/c-00002-2-7646-0-0-0-0-9-2-1.html183.25.64.1560筹翽椀瀀栀琀洀氀簀温5Smwap前台访问/p-1711015.html203.208.60.580筹翽灠岊攀搀栀琀洀氀縀餂罹渪怀/Mi前台访问/p-1873241.html183.135.168.750禙翽遠开搀栀琀洀氀耀夂罾測怀/Me前台访问/p-1873241.ht
26、ml59.52.204.940禙翽遠最脀眀愀瀀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀舀渮5Skwap前台访问/p-1967826.html60.8.123.1810最缀眀愀瀀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀萀。渰蠀/a前台访问/BookRead.aspx?id=1301925106.11.159.590匀洀眀愀瀀瀀栀琀洀氀蘀渰5gwap前台访问/BookRead.aspx?id=137687042.120.161.280愀笀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀蠀簀渲/a前台访问/BookRead.aspx?id=1265535106.11.154.1130愀笀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀言餂罹簟渲怀5Qmwap前台访问/d
27、-450237.html115.225.85.172翽灠撀椀瀀栀琀洀氀谀簀渲/_前台访问/BookRead.aspx?id=550985106.11.156.1090繙翽遠椀搀栀琀洀氀踀渳怀聰/a前台访问/BookRead.aspx?id=2076041106.11.157.390暹翽灠撀开笀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀退渳/u前台访问/c-00019-8-11740-0-0-0-0-9-0-2.html113.100.89.1630朹翽遠最瀀栀琀洀氀鈀渴怀聰/a前台访问/BookRead.aspx?id=210341142.120.160.1240朹翽遠椀搀栀琀洀氀鐀渶怀聰/Mg前台访问/d-
28、1444643.html106.11.158.930暹翽灠撀椀瀀栀琀洀氀阀渶怀聰/Ke前台访问/d-735071.html106.11.159.510暹翽灠撀愀笀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀頀壊游怀聰/Mi前台访问/p-1498920.html114.103.137.130崀眀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀騀葱渹5Mewap前台访问/p-7914.html61.129.8.1790翟愀紀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀鰀渺/So前台访问/sitemap-1664.html45.195.222.2340朹翽偠颜挀瀀栀琀洀氀鸀渻/前台访问/c-0000100007-18-6154-0-0-0-0-9-0-2.
29、html117.95.0.1570硙翽灠撀最瀀栀琀洀氀。塷渻蠀/w前台访问/BookRead.aspx?id=3464842.156.138.170愀紀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀彧渾怀/Kg前台访问/d-972409.html42.120.161.1140朹翽遠最瀀栀琀洀氀彧怚渿怀/Mi前台访问/p-1330093.html106.38.241.1190朹翽遠最瀀栀琀洀氀彧湂怀/Me前台访问/p-2066244.html42.242.11.480朹翽遠愀瀀栀琀洀氀彧鐚湇怀/Mk前台访问/p-1517508.html120.229.245.2290匀欀眀愀瀀瀀栀琀洀氀湈5gwap前台访问/Boo
30、kRead.aspx?id=196428260.8.123.2440朹翽遠攀搀栀琀洀氀彧湌怀/Mg前台访问/p-1459669.html115.230.43.300地堍亜匀漀猀椀琀攀洀愀瀀栀琀洀氀彧湏怀/Mi前台访问/d-2008220.html182.247.36.2420俈眀錀挀栀琀洀氀湐/Qk前台访问/sitemap-180.html157.55.39.1190眣僴最瀀栀琀洀氀湐/y前台访问/c-00001-792-23851-0-0-0-0-3-0-2.html117.71.164.650卌脀餀挀栀琀洀氀彧湓怀/I_前台访问/d-43335.html49.86.57.380呸儀漀眀愀瀀瀀栀琀洀氀彧湕怀/Mg前台访问/p-1486839.html40.77.167.1720喤攀茀眀愀瀀漀漀欀刀攀愀搀愀猀瀀砀椀搀彧湖怀/Mk前台访问/p-1322353.html118.213.220.1900囐儀欀眀愀瀀瀀栀琀洀氀椂鑤湖怀聰/Mi前台访问/p-1356622.html106.38.241.1190朹夨翽遠最瀀栀琀洀氀彧吚湚怀/Mi前台访问/p-1505709.html216.244.66.2000朹婔翽遠最瀀栀琀洀氀彧耚湛怀/Ie前台访问/d-80560.html121.234.204.550眣岬唉椀
